OP9間質細胞によって刺激された臍帯血の血管新生特性の強化により、脳梗塞マウスモデルの神経障害が改善される

Scientific Reports volume 13、記事番号: 262 (2023) この記事を引用

913 アクセス

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

臍帯血（UCB）移植は血管新生促進効果を示し、脳梗塞の動物モデルにおける症状の改善に貢献します。 ただし、不均一な UCB 集団内の特定の細胞タイプの影響については、依然として議論の余地があります。 OP9 は、胚性幹細胞の血内皮分化を促進するフィーダー細胞として使用される間質細胞株です。 したがって、OP9と最大24時間共培養したUCBにおける血管新生特性の変化、根底にあるメカニズム、および脳梗塞によって引き起こされる行動欠陥への影響を調査しました。 ネットワーク形成アッセイでは、OP9 で事前調整された UCB のみがネットワーク構造を形成しました。 単一細胞 RNA シーケンスおよびフローサイトメトリー分析により、OP9 で前処理された UCB の単球画分において M2 への顕著な表現型のシフトが示されました。 さらに、脳梗塞マウスモデルにおけるOP9プレコンディショニングUCB移植は、梗塞周囲病変における血管新生を促進し、関連症状を改善した。 この研究では、OP9 を使用して UCB の M2、組織保護、血管新生促進の特徴を強化するための強力で高速かつ実行可能な方法を開発しました。 インビボでのＯＰ９でプレコンディショニングしたＵＣＢの改善効果は、部分的には梗塞周囲病変における自然血管新生の促進によるものである可能性がある。

脳梗塞は、永続的な障害や死亡の主な原因の 1 つです。 現在、虚血性周縁部を防ぐために、急性期には静脈内血栓溶解剤および血管内再開通療法が広く使用されている。 しかし、これらの治療法は時間枠が狭く、治療適応は特定の患者集団に限定されています1。 したがって、脳梗塞に対する治療の革新が必要であり、非常に要求が高いです。

細胞治療は、従来の再灌流療法と比較して、亜急性期や慢性期の治療であっても関連症状を改善する可能性があることから、今後の脳梗塞治療への適用範囲がさらに広がることが期待されています3。

これまでの研究では、臍帯血 (UCB) および成人末梢血 (PB) には、活動的な血管新生部位に蓄積し、血管新生に寄与する可能性のある特定の単核画分が含まれていることが示唆されています 4,5。 浅原ら。 ヒト PB 由来単核細胞 (PB-MNC) から選別された CD34+ 造血細胞集団は、フィブロネクチンでコーティングされたディッシュ上にプレーティングすることによって普遍的な造血マーカー CD45 を持つ紡錘形細胞を生成し、後肢虚血モデルで血管新生を促進できることを最初に説明しました 6 。 同様の結果が Kalka らによって報告されました。 CD34 ソーティングを行わずに初代接着単核細胞を使用する 7。

それ以来、単核細胞画分の不均一な集団内の血管新生促進細胞集団が広範囲に研究されてきました。 UCB または PB の CD34+CD45+ 造血前駆細胞に含まれる CD14+CD45+ 単球細胞は、Asahara によって報告されたものと同様の細胞クラスターを形成することが示されています 8。一方、他のいくつかの研究では、PB の CD34-CD14+ 単球画分が同様の特徴を有することが報告されています 9,10。 一方、血管新生促進細胞の集団は、骨髄前駆細胞および顆粒球マクロファージ前駆細胞に由来することが示されています11。 これらの発見は、単球にはさまざまな機能的表現型（つまり、M1 および M2）があり、M2 単球は血管新生 12 および神経新生、軸索の発芽、および再ミエリン化の促進 13 に関連しているのに対し、M1 単球は血管新生 12 に関連しているというよく知られた概念と一致しています。単球は炎症促進性であり、組織の損傷を媒介します。

実際、そのような細胞画分は、虚血後肢や心筋梗塞などの虚血組織の血管再生を促進することが示されています14、15。 さらに、血管新生は脳梗塞後の神経学的回復と正の相関があることが知られています16。 いくつかの研究では、UCB移植が血管新生促進効果を示し、脳梗塞の動物モデルにおける虚血量の減少または症状の改善に寄与することが実証されました17、18、19。 しかし、これらの研究のほとんどは、Kalka らによって報告されたものと同様の粗 UCB17、19、20 または UCB 由来単核細胞 18、21 を使用しました。 さらに、脳梗塞モデルにおける UCB 由来単核細胞 6 から選別された CD34+ 細胞の有効性については議論の余地があります 21,22。

これらの発見により、我々は、UCBにおけるより特異的な血管新生促進細胞集団の増加が治療効果の向上につながるという仮説を立てました。 この仮説に基づいて、我々は、胚性幹細胞の赤血球、骨髄、リンパ球への分化を促進するフィーダー細胞株として最初に使用された間質細胞株である OP9 の特徴に焦点を当てました 23。 また、肝臓前胚内造血部位に由来する細胞集団から内皮細胞および造血細胞への分化を促進することも知られています 24。 さらに、血管の内面に由来する特定の内皮前駆細胞集団がいくつかの臓器で最近報告されました。 OP9 は、それらの増殖、コロニー形成、および成熟内皮細胞への分化を効果的に促進しました 25。 したがって、OP9 は UCB の血管新生特性を増強するのに適している可能性があります。

本研究では、OP9でプライミングしたUCB細胞の新たな培養法を確立しました。 私たちは、UCBのこの「プレコンディショニング」方法が血管新生特性を強化できるかどうかを調査し、外科的閉塞を使用したマウスモデルの実験的局所脳梗塞によって引き起こされる行動欠陥に対する根底にあるメカニズムとOP9プレコンディショニングUCBの影響を特定しました。中大脳動脈（MCAO）の。

マトリゲルを用いた in vitro ネットワーク形成アッセイは、培養細胞の血管新生促進能力を評価するために長年使用されてきました 5、8、10、26、27、28、29。 UCB細胞の血管新生促進特性を評価するために、PB-MNC、UCB細胞、およびOP9で事前調整されたUCB細胞を使用してアッセイを実行しました（図1a）。 驚くべきことに、24時間以内の短い共培養の後、OP9でプレコンディショニングしたUCB細胞は毛細管様構造を形成しましたが、プレコンディショニングなしのUCB細胞ではそのような構造は観察されませんでした（図2a、b）。 ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）とインキュベートすると、OP9でプレコンディショニングしたUCB細胞はHUVECと不均一に整列した厚くて固体のネットワーク構造を形成しましたが、OP9でプレコンディショニングしていないUCB細胞はHUVECとそのような構造的整列を形成できませんでした（図2c） 、d）。 OP9で事前調整されたUCB細胞と比較して、HUVECはまた、それ自体で薄くて弱いネットワーク構造を形成しました（図2e）。 PB-MNCを対照として使用しましたが、OP9プレコンディショニング後でもHUVECと毛細管状構造を形成できませんでした（図2f）。 OP9 細胞単独では毛細管様構造は形成されませんでした (データは示されていません)。

研究の方法論的な概略図。 (a) ネットワーク形成アッセイのプロトコル。 RBC 除去ヒト臍帯血 (UCB) 細胞と末梢血由来単核細胞 (PB-MNC) を 10 cm ディッシュ内の OP9 間質細胞上で共培養しました (つまり、OP9 プレコンディショニング)。 18 ～ 24 時間培養した後、接着細胞を回収し、in vitro ネットワーク形成アッセイに供しました。 フィブロネクチンでコーティングされたディッシュ上で培養されたＲＢＣ枯渇粗ＵＣＢ細胞およびＰＢ－ＭＮＣを対照として使用した。 (b) 単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) およびフローサイトメトリーのプロトコル。 RBCを枯渇させた粗UCB細胞を対照として使用した。 (c) MCAO マウスモデルにおける OP9 プレコンディショニング済み UCB の静脈内投与のプロトコル。 マウスは以下の 3 つのグループにランダムに割り当てられました。UCB + OP9 グループ (n = 11)。 対照群（n = 11）。 および偽手術グループ (n = 12) は MCAO または偽手術を受けました。 手術の 2 週間後、UCB + OP9 グループのマウスには 100 μL の OP9 プレコンディショニング済み UCB (2.0 × 107 細胞/kg) が投与され、対照グループのマウスには同量の乳酸リンゲル液が静脈内投与されました (iv.)。細胞移植の 1 か月後、一連の行動検査を実施し、細胞移植の 3 か月後、UCB + OP9 群の 5 匹のマウスと対照群の 5 匹のマウスをランダムに選択し、免疫組織化学を行いました。

OP9 プレコンディショニングの有無にかかわらず、UCB または PB-MNC 由来の接着細胞を使用した in vitro ネットワーク形成アッセイ。 (a ～ f) のパネル名は、図 1a の (a ～ f) のパネル名と同じです。 OP9 プレコンディショニングの有無にかかわらず、UCB または PB-MNC 由来の接着細胞をマトリゲル上に播種しました。 ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) をパネル (c) ～ (f) に追加しました。 (a) 毛細管様構造を示す OP9 でプレコンディショニングされた UCB 細胞。 (b) OP9 プレコンディショニングを行わない UCB セル。 (c) HUVEC を含む OP9 でプレコンディショニングされた UCB 細胞。 (d) OP9 プレコンディショニングを行わない HUVEC および UCB 細胞。 (e) HUVEC のみ (OP9 プレコンディショニングなし)。 (f) HUVEC と共培養した OP9 でプレコンディショニングした PB-MNC。 スケールバー: 100 μm、倍率 10 倍。

したがって、OP9 プレコンディショニングは、PB-MNC では誘導されなかった UCB 細胞の血管新生促進特性を 24 時間以内に増強しました。

UCB 細胞には不均一な細胞集団が含まれるため、OP9 プレコンディショニングの影響を受ける細胞タイプを明らかにする必要があります。 単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) を使用して、各細胞集団の遺伝子発現プロファイルの変化を評価し、OP9 前処理済み UCB 細胞と粗 UCB 細胞の両方を比較しました (補足図 1)。 t 分布確率的近傍埋め込み (tSNE) を使用した教師なしクラスタリングを使用して、すべての UCB 細胞を転写的に異なるクラスターに組織化し、各クラスター内で差次的に発現されるマーカー遺伝子を同定しました。 単球、顆粒球、造血幹細胞、血管新生促進効果があることが知られている骨髄性および顆粒球マクロファージ前駆細胞（CMP / GMP）のクラスターを含む、合計25の安定したクラスターが出現しました（補足図1）。 各細胞タイプで優先的に発現される遺伝子のリストは補足データに記載されています。 バイオリンプロットと、単球で優先的に発現すると考えられる遺伝子であるCD14およびCGR3Aの遺伝子発現分布図は、クラスター4の細胞が主に単球で構成されていることが示唆されました（補足図1）。 単球画分は、粗製UCB細胞よりもOP9プレコンディショニングUCB細胞の方がかなり高かった(8.0%対5.3%)が、造血幹細胞およびCMP/GMPの細胞数は変化しなかった(0.6%対1.1%)。それぞれ % および 0.6% 対 0.4%) (補足図 1)。

M1 表現型の単球は炎症促進性であり、組織損傷を媒介しますが、M2 表現型は血管新生に関連します。 そこで、単球クラスターの遺伝子発現の特徴に焦点を当てました。 典型的な M1 および M2 サイン遺伝子のヒートマップは、遺伝子発現プロファイルの明確な傾向を示しました。マクロファージ活性化因子 (MAF) や CD163 などの M2 マーカー遺伝子は、OP9 で事前調整された UCB の単球クラスターで豊富に発現されていました。一方、M1特異的遺伝子発現は粗製UCBからの発現の方が高かった（図3a）。 これらの所見は、OP9 で前処理した UCB からの単球クラスターが、粗製 UCB からの単球クラスターと比較して M2 表現型の方へシフトしたことを示唆しています。

粗製 UCB および OP9 プレコンディショニング済み UCB 細胞の単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) およびフローサイトメトリー分析。 (a) 典型的な M1 および M2 特徴遺伝子のヒートマップ。 右側のサイドバーは、M1 および M2 の署名遺伝子をそれぞれ青と赤で示しています。 スケール バーは、対数正規化された固有分子指数 (UMI) カウントから計算された遺伝子発現レベルを示します (スケール ファクター = 10,000)。 (b) 粗製 UCB と UCB + OP9 の間で差次的に発現された遺伝子の遺伝子オントロジー (GO) 濃縮分析。 強化された GO 用語は超幾何検定に基づいて特定され、調整された p 値は Benjamini and Hochberg (BH) 法によって導出されました。 上位 15 の強化された GO 用語が -log10 p 値に従って表示されました。 (c、d) UCB および UCB + OP9 のフローサイトメトリー分析。 細胞生存率（すべての事象に対する生細胞の比率）は、DAPI 染色を使用して分析されました。 単球画分 (P1 集団) の細胞は、前方角光散乱 (FSC) および側角光散乱 (SSC) 特性に基づいてゲートされました。 次に、CD80 と CD206 を使用して、M1 型細胞と M2 型細胞をそれぞれ Q4 象限と Q1 象限に分類しました。

さらに、OP9 前処理済みの単球クラスターと粗製 UCB の間で差次的に発現された遺伝子の遺伝子オントロジー (GO) 分析により、GO ターム濃縮の特徴的な傾向が明らかになりました。 低酸素、解糖、酸化経路に関連する GO 用語の濃縮 p 値が最も高かった（図 3b）。 これらの所見は、低酸素症が単球を主に解糖を通じてエネルギーが得られるM1表現型にシフトするのに対し、M2単球では酸化経路を通じてエネルギーが得られることを考慮すると、細胞内代謝変化に関するヒートマップの結果と一致している。 単球画分における血管新生促進機構をさらに調査するために、OP9 でプレコンディショニングした UCB と粗製 UCB の単球クラスターにおける血管新生の発芽に関与する細胞遊走の調節に関連する遺伝子発現プロファイル (GO:0090049) を比較しました。 これらの遺伝子は、OP9 で前処理した UCB の単球クラスターで広く上方制御されていました (表 1)。 これらの遺伝子のうち、ニューロピリン 1 (Nrp1) の発現は、粗 UCB と比較して、OP9 で前処理した単球画分で増強されました。 Nrp1 は、VEGF165 およびクラス 3 セマフォリンと結合する膜貫通受容体であり、単球の特定の血管新生促進性集団 (すなわち、ニューロピリン-1 発現単球; NEM) で発現されることが知られています 31。 したがって、OP9 でプレコンディショニングされた単球画分の血管新生促進機構は、OP9 プレコンディショニングによる NEM の増加によって部分的に説明できる可能性があります。

scRNA-seq の結果を補強するために、フローサイトメトリー分析を使用して、これら 2 つの単球画分の M1/M2 表現型シフトを調査しました。 まず、4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール (DAPI) 染色を使用して UCB 細胞の生存率を評価しました。これにより、粗製 UCB よりも OP9 でプレコンディショニングした UCB での UCB 細胞の生存率が高いことが明らかになりました (96.1% 対 81.3%)。全イベントの%;図 3c)、OP9 の保護効果を示唆しています。 CD80 と CD206 は、M1 単球と M2 単球を区別するために使用されました 32,33。 CD80-CD206+ M2 型細胞数のパーセンテージは、粗製 UCB からの単球画分と比較して、OP9 でプレコンディショニングした UCB からの単球画分ではるかに高かった (27.9% 対 1.7%; 図 3c の Q1 象限)。総単球細胞は、OP9 前処理細胞と粗 UCB 由来細胞の両方で同等でした (全生細胞の 3.3% 対 2.2%; 図 3c の P2 集団)。

さらに、OP9 プレコンディショニングによる PB-MNC の M1-M2 シフトの顕著な傾向も観察されました。 CD80- CD206+ 細胞の割合は実質的に高く (43.0% 対 7.6%; 図 3d の Q1 象限)、CD80+ CD206- 細胞の割合は低かった (3.3% 対 11.4%; 図 3d の Q4 象限)。粗PB-MNCからの単球画分と比較した、OP9でプレコンディショニングしたPB-MNCからの単球画分における。

scRNA-seq のいくつかの顆粒球クラスターでは、顆粒球の割合は、粗製 UCB 細胞よりも OP9 で事前調整した UCB 細胞の方が高かった (顆粒球_3、4、および_5、補足図 1)。 単球と同様に、好中球も血管新生を誘導する N2 表現型を持つことが知られています 34。 したがって、顆粒球画分でも同じフローサイトメトリー分析を実行しました（補足図2のSSCおよびFSC特性によってゲートされたP2集団）。 ただし、CD80-CD206+ N2 型細胞は、OP9 で前処理した UCB の顆粒球画分の 0.12% にしか見つかりませんでした (補足図 2 の Q1 象限)。

全体として、24 時間の短時間 OP9 プレコンディショニングは、UCB 細胞および PB-MNC の単球画分の表現型特性を M2 優勢状態に向かって強くシフトさせ、また、UCB 細胞の生存率に関するその保護効果も示しました。

ＯＰ９でプレコンディショニングしたＵＣＢ細胞の血管新生促進効果を、ＭＣＡＯマウスモデルにおける静脈内投与によって評価した。 血管新生が顕著な修復プロセスは、脳梗塞後の亜急性期に起こります 35,36。 したがって、梗塞周囲病変の微小血管の密度が報告されていることを考慮して、血管新生プロセスを強化するためにMCAO誘導の2週間後にOP9プレコンディショニングUCB細胞を投与し、UCB投与の3か月後にこれらのMCAOマウスを屠殺しました（図1b）。 30日目までにピークに達し、3か月以内に徐々に減少します37。 限局性虚血性梗塞の形態学的観察は、以前の報告で報告されたものと同様であり、虚血性梗塞の脳表面には小さな動脈があり、正常皮質に隣接する虚血性梗塞の周囲に位置する梗塞周囲病変には微小血管が存在していた。および線条体（図4a）。 我々は、CD31+/vWF+（フォン・ヴィレブランド因子）細胞の面積測定および細胞計数によって、梗塞周囲病変における微小血管の密度を評価した。 CD31 / vWF二重陽性領域は、ビヒクル対照（n = 5）よりもOP9プレコンディショニングUCB投与群（n = 5）の方が有意に高かった（***p < 0.001;図4b、c） ）。 この結果は、OP9で事前調整したUCB細胞が、粗製のUCB細胞と比較して、MCAOマウスの梗塞周囲病変に対して顕著な血管新生促進効果を有していたことを示唆している。

OP9でプレコンディショニングしたUCB投与の有無にかかわらず、MCAOマウスの梗塞周囲病変におけるvWFおよびCD31染色。 手術後 3.5 か月後に蛍光免疫組織化学を実施しました (それぞれ、UCB + OP9 グループで n = 5、対照グループで n = 5)。 (a) 蛍光顕微鏡によるCD31/vWF（フォン・ヴィレブランド因子）二重陽性細胞の面積測定の対象領域の模式図。 マウスあたり 1 つの冠状切片 (各グループ n = 5) を分析しました。 虚血性梗塞の脳表面の小動脈 (‡) と、正常皮質および線条体に隣接する虚血性梗塞の周囲に位置する梗塞周囲病変の微小血管 (†) が観察されました。 冠状断面ごとに赤色の実線ボックスで示される (†) の 3 つの重複しないランダム視野 (倍率 400 倍) を分析して、CD31/vWF 二重陽性領域を測定しました。 (b) 脳切片の免疫蛍光染色の代表的な画像。 梗塞周囲病変（†）におけるCD31+（緑色）およびvWF+（赤色）を伴うCD31/vWF二重陽性細胞（黄色）を（c）の分析に供した。 核は DAPI (青) を使用して対比染色されました。 スケールバー: 50 μm。 倍率200倍。 (c) 倍率 400 倍で観察された視野あたりの CD31+/vWF+ 細胞の面積測定と細胞数 (各グループあたり n = 15)。 ***p < 0.001、対応のない t 検定。

最後に、MCAO マウスで行動試験を実行し、脳梗塞によって引き起こされる神経障害の改善に対する OP9 プレコンディショニング UCB の効果を評価しました。 図に示すように、手術後 1.5 か月後に行動テストを実施し、3 つのグループ [UCB + OP9 グループ (n = 11)、対照グループ (n = 11)、および偽手術グループ (n = 12)] 内で比較しました。 .1c.

多重比較の前に、Y 迷路タスクの一元配置分散分析 (ANOVA) が実行され、有意性が示されました [F(2) = 19.35、p < 0.0001]。 さらに、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ（ｒｍＡＮＯＶＡ）（すなわち、オープンフィールドテスト、受動的回避学習タスク、および強制水泳テスト）は、すべてのタスクにおけるグループの有意性を明らかにした［Ｆ（２、３２）＝１０．６０、 p < 0.0003; F(2, 32) = 6.08、p = 0.0058; それぞれ F(2, 32)、p < 0.0001]、受動的回避学習タスクの時間効果 [F(2, 31) = 14.48、p < 0.0001]、および強制学習におけるグループによる時間相互作用においても同様です。水泳テスト [F(10, 160) = 3.179、p = 0.001]。 ただし、ワイヤー ハング テストの rmANOVA は有意性を示せませんでした。

多重比較では、まず対照群と偽手術群を比較して、MCAO誘導が各行動検査のスコアに影響を与えるかどうか、またこれらの検査がMCAOによって引き起こされる異常な神経機能を検出するのに適しているかどうかを評価しました。 オープンフィールド試験では、対照群の移動距離は、実験期間を通じて偽手術群よりも有意に長く、対照群における慣れと不安の異常な欠如を反映していた(*p<0.05、**p<0.01) 、***p < 0.001、図 5a)。 rmANOVA における時間効果は統計的に有意ではありませんでしたが、偽手術グループでは時間に依存して移動距離が減少する傾向が観察され、オープン フィールド テストでの正常な慣れ反応が示されました。 Y字迷路課題では、偽手術群と比較して対照群の交替率が有意に減少し、対照群の作業記憶の障害が示唆されました（*p<0.05;図5b）。 さらに、受動的回避学習課題では、試行日ごとに偽手術群のステップスルー潜時が延​​長したが、対照群では変化がなかったことから、偽手術群のマウスは回避行動の獲得に成功したが、対照群のマウスはそうではなかったが、これは侵害受容性記憶障害に起因する可能性がある（††p < 0.01、* p < 0.05、図5c）。 強制水泳試験では、偽手術群のマウスは対照群のマウスよりも不動時間が短いことが示され、これはMCAOマウスにおける意欲の喪失と運動耐性の障害の発生を示しています（**p < 0.01、***） p < 0.001;図 5e)。

OP9で事前調整されたUCB投与の有無にかかわらず、MCAOマウスの行動試験。 マウスは、UCB + OP9 グループ (n = 11)、対照グループ (n = 11)、および偽手術グループ (n = 12) の 3 つのグループにランダムに割り当てられました。 オープンフィールドテスト（a）、Y字迷路課題（b）、受動的回避学習テスト（c）、ワイヤーハングテスト（d）、および強制水泳テストを手術の1.5か月後に実施しました。 複数の比較の前に、Y 字迷路タスクについては一元配置の分散分析、および反復測定から生じたデータについては二元配置の反復測定 ANOVA (つまり、オープン フィールド テスト、受動的回避学習タスク、ワイヤー ハング テスト、および強制水泳テスト）を使用しました。 A; p < 0.05、被験者間の差異に関するダネット検定。 *p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、偽手術群と対照群（すなわち、MCAO誘発群）との比較におけるダネット検定。 ＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、ＯＰ９＋ＵＣＢ群（すなわち、ＭＣＡＯ誘発およびＯＰ９プレコンディショニングＵＣＢ投与群）と対照群との比較におけるダネット検定。 †p < 0.05、††p < 0.01、各グループのコンディショニング試験と比較したダネット検定。

次に、行動課題スコアに対する OP9 事前調整 UCB 細胞の改善効果を調査するために、対照群と OP9 + UCB グループを比較しました。 オープンフィールドテスト、Y 字迷路テスト、受動的回避学習課題、および強制水泳テストのスコアは、OP9 + UCB グループの方が対照グループよりも有意に優れていました (#p < 0.05、##p < 0.01、†) †p < 0.01)。 ワイヤーハングテストでは、3つのグループ間の有意差を検出できませんでした（図5d）。これは、MCAOモデルが局所的な運動障害から急速に回復することが知られており、運動機能に対する改善効果を検出するには必ずしも十分ではないためです39,40。 。 しかし、低下するまでの潜伏期間はMCAO誘導によって短縮され（すなわち、偽手術群よりも対照群のほうが短い）、OP9で前処理したUCB細胞の投与によって改善される（すなわち、偽手術群よりも長い）という傾向があった。 OP9 + CUB グループは対照グループよりも優れています)。これは、筋力低下と運動耐性における OP9 で事前調整された UCB 細胞の改善効果を示唆しています。 したがって、これらの結果は、一般活動、記憶障害、運動耐性、うつ病様症状などの MCAO によって引き起こされる行動異常が、OP9 プレコンディショニング済み UCB 細胞の投与によって改善されたことを示しています。

今回の研究は、OP9が単球画分の表現型を血管新生M2優勢状態にシフトさせることによって（図3）、一部にはUCB細胞の血管新生促進特性を強力かつ迅速に増強することを実証した（図2）。 また、OP9 でプレコンディショニングした UCB 細胞の亜急性静脈内投与が、梗塞周囲病変における自然血管新生の促進に部分的に起因して、MCAO マウスモデルにおける神経学的欠損を改善することも実証されました (図 4)。 私たちの知る限り、これは、血管新生促進機能を強化し、亜急性脳梗塞モデルにおけるその生物学的効果を検証するための、UCB の強力で簡単かつ迅速な修飾技術を報告した最初の研究です。

浅原ら。 は、活動的な血管新生部位に蓄積することによって血管新生に寄与する可能性がある循環細胞集団である内皮前駆細胞 (EPC) の命名法を初めて説明しました 6。 in vitro 細胞培養アッセイでは、初期 EPC と後期 EPC の 2 つの異なる EPC 集団が報告されています。前者は骨髄性血管新生細胞 (MAC) または血管新生促進性造血細胞とも呼ばれ、後者は内皮コロニー形成細胞とも呼ばれます ( ECFC）または内皮増殖細胞41、42。 それらは両方とも、内皮細胞培養条件下でフィブロネクチンまたはコラーゲンでコーティングされたディッシュ上に播種された PB-MNC から単離された接着細胞でしたが、培養中に生じる時間が異なりました 26、29、43、44。 当初、初期 EPC は 2 ～ 3 週間で出現し、4 週間で停止する紡錘形の細胞集団であるのに対し、後期 EPC は 2 ～ 3 週間で出現し、4 ～ 8 週間で指数関数的に増殖する丸石状の細胞集団であり、老化することなく複数の集団倍加能力を持っていた27。 ECFC は、顕著な増殖能力、Matrigel におけるネットワーク形成能、および in vivo での新規血管形成に寄与する能力など、特有の内皮前駆細胞の特徴を備えています 26、29、45。 対照的に、MAC は ECFC の特性をまったく共有しませんが、造血由来の単球の特徴 (すなわち、骨髄前駆細胞マーカーの発現およびマクロファージに分化する能力) を持ち、パラクリン機構を通じて血管新生を促進します 12,43,44,45 、46。

以前の研究に基づくと、MAC には単球画分が含まれており、血管新生を促進する細胞療法に広く使用されている細胞集団と同様の特性を持っています 14。 当社の OP9 プレコンディショニング済み UCB 細胞には、パラクリン機構による血管新生促進効果などの MAC の特性を持つ単球画分も含まれています。 ただし、ネットワーク形成アッセイでは、OP9 で事前調整された UCB 細胞はネットワーク構造を形成し、HUVEC と不均一に整列しましたが、PB-MNC はネットワーク構造を形成しませんでしたが、PB-MNC と UCB 細胞は両方ともOP9のプレコンディショニング。 したがって、ネットワーク形成アッセイでの我々の結果を次のように解釈するのが適切であると思われます：（i）我々のOP9プレコンディショニングは、UCB細胞の単球画分をM2表現型にシフトさせ、血管新生促進効果を強化しました、（ii）これら単球は内皮細胞に分化せず、(iii) OP9 プレコンディショニングは、周囲の M2 シフト血管新生促進性単球によってサポートされ、UCB 細胞の別の未定義の集団が HUVEC と不均一にネットワークのコア構造に参加して整列することを促進する可能性があります。 以前の報告では、MAC と ECFC が血管新生に対して相乗効果を有し 43、未分画の UCB 由来単核細胞が、梗塞体積の減少と神経障害の改善に対する効果の点で CD34+ または CD34- 細胞分画よりも優れていることが実証されました 21。 したがって、これらの発見は、OP9と共培養した未分画UCB細胞を使用する我々の方法が、血管新生に関連するいくつかの自然細胞集団が含まれ、特定の細胞集団を単離することなくOP9によって同時に調節される、血管新生の特徴を増強するためのより良いアプローチであることを示唆しています。

さまざまな細胞ソースの中でも、UCB は細胞治療のドナーソースとしての臨床応用、特に血管新生を目的とした場合にいくつかの利点があります。 まず、UCB には高い増殖能を持つ幹細胞が含まれています 47。 第二に、UCB には PB や骨髄よりも多量の血管新生促進細胞集団が含まれています 48,49。 第三に、UCB 移植は診療所で採用されてきた長い歴史があり 50、骨髄移植よりも移植片対宿主病の発生率と重症度が低い 51,52。 最後に、UCBは出生後に廃棄されることが多いため、低侵襲かつ容易に入手でき、安定供給体制が確立されています。 これらの特徴は、細胞治療における UCB の使用と調節に対する我々のアプローチをさらに裏付けています。

いくつかの研究では、M2 マクロファージが間葉系幹細胞 (MSC) との共培養によって生成できることが示されています 53、54、55。 さらに、MSC由来の上清はマクロファージを抗炎症表現型に向けて増強する可能性があり、そのような「教育されたマクロファージ」の投与は腱損傷の治癒過程を大幅に改善し、内因性M1/M2マクロファージ比を低下させ、血管新生を促進した56。

OP9 は、血内皮分化を促進するフィーダー細胞として広く知られていますが、免疫表現型、分化能力、免疫調節効果など、MSC といくつかの特徴を共有することも知られています 57。 通常、骨髄単球細胞を取得するのに数日かかるのに対し、UCBとOP9をわずか1日間共培養したことを考慮すると、UCB細胞におけるOP9プレコンディショニングの根底にあるメカニズムは、幹細胞や前駆細胞の分化ではなく「単球教育」によるものである可能性があります。 OP958を使用した胚性幹細胞からの分化による。

インビボでの M2 シフト単球の根底にある血管新生促進分子機構は明らかにされていませんでしたが、scRNA-seq の単球画分の発現プロファイルから興味深い洞察が得られました。 Nrp1 の発現は、粗 UCB と比較して、OP9 で前処理した単球画分で増強されました。 最近、いくつかの研究により、(i) 特定の単球集団が膜貫通受容体として Nrp1 を発現していること (すなわち、ニューロピリン-1 発現単球; NEM)、(ii) Nrp1 が VEGF165 およびクラス 3 セマフォリンと結合し、化学誘引を媒介していることが実証されました。 (iii) NEM 自体は血管構造に組み込まれていないが、NEM は平滑筋細胞を動員し、動脈形成における血管成熟を促進し、異常な血管透過性を低下させることができます 31,59,60,61。

現在の研究には一定の限界がありました。 第一に、我々は、OP9 プレコンディショニング済み UCB と粗製 UCB の間の虚血性脳卒中に対する効果の違いを評価しませんでした。 第二に、この原稿の範囲を超えていますが、UCB 由来 AC133+ 前駆細胞 5,62 や UCB 由来 ECFC26 などの単球画分以外の細胞集団に対する OP9 の効果を評価する必要があります。細胞サブセットは、脳卒中後の神経学的回復を妨げると報告されています21,63。 この点に関して、scRNA-seq を使用した遺伝子発現プロファイルのさらなる分析は、これらの質問に答える手がかりを提供する可能性があります。 第三に、我々は投与されたUCBの脳への生着を検証しなかったし、これらのUCB由来細胞が分化して修復組織の構造に関与したかどうかも調査しなかった。 いくつかの報告では、UCB 由来細胞の生着が実証されています 18、20、62、64、65 が、失敗した報告もあります 21、22。 また、それらの差別化能力についても議論の余地があります。 これらの所見の矛盾は、部分的には、梗塞後のUCB投与のタイムライン（MCAO後24時間～1週間）、組織学的分析のタイムライン（1週間～1か月）、およびヒト由来UCB細胞の検出方法の違いによるものである。 それにもかかわらず、今回の研究における症状改善のメカニズムは、以前に報告されている、先天性組織修復プロセスに対するOP9で事前調整されたUCB細胞の血管新生促進効果によって部分的に説明できます17、19、62。

これらの制限は存在しますが、当社の OP9 プレコンディショニング方法は、その迅速さ、便利さ、実現可能な特徴、さらに血管新生促進性の組織保護表現型である M2 に向けた UCB の生物活性の調節に対する強力な効果の点で依然として優れています。 。

この研究では、OP9と共培養することにより、UCBのM2、血管新生促進、組織保護の特徴を強化する強力かつ迅速な方法を発見しました。 さらに、我々は、OP9 プレコンディショニング UCB の亜急性投与が、部分的に梗塞周囲病変における先天性血管新生の促進により、マウスモデルにおける MCAO によって誘発される行動欠陥を改善することを実証した。

UCBまたはPBを提供したすべてのドナーから書面によるインフォームドコンセントが得られ、研究プロトコールは兵庫医科大学の倫理委員会によって承認され（承認番号0325）、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。

OP9 細胞は、高倉信行博士 (日本、大阪大学微生物病研究所シグナル伝達部門) から入手し、ヌクレオシドを添加したα最小必須培地 (Thermo Fisher Scientific、41061-029; Waltham、MA) で維持しました。 20% ウシ胎児血清 (Biowest, S1820; Nuaille, France) およびペニシリン - ストレプトマイシン (Sigma-Aldrich, P7539; St. Louis, MO, USA)。

ヒト臍帯由来 HUVEC は Lonza (C2517A; バーゼル、スイス) から購入し、EGM-2 培地 (CC-3162; Lonza) で維持しました。

メーカーのプロトコールに従って、EasySep RBC Depletion Reagent (Stem Cell Technologies、バンクーバー、カナダ) および Ficoll-Paque PLUS (Cytiva、17144002、MA) を使用して、RBC 除去 UCB および PB-MNC を得ました。 細胞を、上皮成長因子（Peprotech、AF100-15; Cranbury、NJ）、線維芽細胞成長因子塩基性（Peprotech、100-18B）、N-2（ Thermo Fisher Scientific、17502048）および抗生物質抗真菌薬（Thermo Fisher Scientific、15240-062）を使用し、10 cm 培養皿内で 1 × 106 細胞の密度で OP9 間質細胞上で共培養（OP9 プレコンディショニング）しました。 /cm2。 18〜24時間の培養後、非接着細胞を除去し、接着細胞をトリプシン処理によって収集し、培地で1回洗浄した後、マウスモデルでのin vitroネットワーク形成アッセイ、フローサイトメトリー分析、および静脈内投与に供しました。 scRNA-seq では、OP9 プレコンディショニング後に、RBC 枯渇 UCB に由来する接着細胞と上清細胞の組み合わせを使用しました。 フィブロネクチンコートディッシュ上で培養したＲＢＣ除去粗ＵＣＢから得た接着細胞を、ネットワーク形成アッセイの対照として使用した。 逆に、RBC を枯渇させた粗製 UCB 細胞および PB-MNC を、scRNA-seq および/またはフローサイトメトリー分析の対照として使用しました。

OP9 プレコンディショニングの有無にかかわらず、UCB または PB 由来の接着細胞を、マトリゲル マトリックス (Corning Inc.、354234; Corning、NY、USA) でコーティングされた 24 ウェル組織培養プレートに 1 × 105 細胞/個の密度で播種しました。良い。 5% UCB 血清を含む DMEM (Thermo Fisher Scientific、11885-084) を添加し、37℃、5% CO2 で 24 時間インキュベートした後、倒立顕微鏡 (BZ-X710、Keyence Corporation、大阪、日本) を使用して細胞を観察しました。 ; DMi8、Leica Microsystems、Watzler、ドイツ) 相互接続されたネットワーク構造として定義される毛細管状の形成を 10 倍に拡大。

共培養実験では、メーカーのプロトコールに従って赤色蛍光膜標識キット (Sigma-Aldrich、MINI26) を使用して HUVEC を標識しました。 HUVEC をマトリゲル中で 1 × 105 個の接着細胞と 1:5 の比率で混合しました。

単一細胞の単離、cDNA の調製、RNA-seq ライブラリーの構築、cDNA シークエンシング、および処理を含む RNA-seq ライブラリーの構築と cDNA シークエンシングは、大阪大学ゲノム情報研究センターの NGS コア施設 (大阪府) によって実行されました。日本）。 scRNA-seq に由来する解析とグラフィック表示は Genble Inc. (福岡、日本) によって実行されました。 詳細は補足方法3で説明します。

細胞を蛍光結合抗体(表2に示す)とともに暗所で26℃で20分間インキュベートし、PBSで2回洗浄した。 分析前に、Cellstain-DAPI 溶液 (1:500、同仁堂、340-07971; 熊本県) を使用して細胞を染色し、死んだ細胞を除去しました。 染色後、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた分析のために細胞を５００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。 フローサイトメトリーデータ分析は、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences)を使用して実施した。 各サンプルについて少なくとも 20,000 のイベントが記録されました。 染色されていない細胞を対照サンプルとして使用して、データ分析の適切な設定を決定しました。

実験手順は、兵庫医科大学動物管理委員会によって承認され（承認番号：19-040）、ARRIVE ガイドラインおよび米国科学アカデミー発行の「実験動物の管理と使用のガイド」に従って実施されました。アメリカ合衆国。 生後 7 ～ 9 週齢の雄 CB-17/Icr-+/+Jcl マウス (日本クレア株式会社、東京、日本) を、温度 (22 ～ 24 °C) および湿度 (55%) に制御された部屋で飼育しました。 12/12の明暗スケジュール。 動物には、水および標準的なペレット飼料を自由に摂取させた。

マウスは以下の 3 つのグループにランダムに割り当てられました:UCB + OP9 グループ (MCAO の後に OP9 プレコンディショニング済み UCB を投与; n = 11)。 対照群（MCAO後に乳酸リンゲル液のみを投与したビヒクル対照群; n = 11）、および偽手術群（n = 12）。 手術の2週間後、UCB + OP9グループのマウスにはOP9でプレコンディショニングしたUCB（2.0×107細胞/kg）100μLを投与し、対照グループのマウスには直視下で頸動脈経由で同量の乳酸リンゲル液を投与しました。 。

永続的な限局性脳梗塞は、以前に記載されているように MCAO によって誘発されました 40。 簡単に説明すると、2%イソフルラン(富士フイルム和光純薬株式会社、099-06571;大阪、日本)による全身麻酔下で、左目と左耳の間の皮膚を切開した。 手術用顕微鏡下で歯科用ドリルを使用して左頬骨を除去した後、頭蓋骨の表面に直径 1.5 mm の骨窓を作成しました。 最後に、中大脳動脈の近位部分を頭蓋底近くで露出させ、嗅道のすぐ遠位で切断しました。 現在の研究で使用されているこの MCAO モデルは、慢性期 (つまり、MCAO 誘導後 14 日) であっても、明確に境界が定められた再現可能な脳卒中領域を有することが知られています 66。

UCB は免疫原性が低いことが知られているため、免疫抑制剤は投与されず、いくつかの研究では免疫抑制剤なしでの異種移植後の生着が報告されています 20,67。

細胞移植から 3 か月後、イソフルラン (富士フイルム和光純薬株式会社) を使用した全身麻酔後、UCB + OP9 群の 5 匹のマウスと対照群の 5 匹のマウスに PBS と 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を経心的に灌流しました。 脳を取り出し、4％PFAで一晩固定し、30％スクロースで脱水し、-80℃で凍結し、クライオスタット（NX70; PHC、東京、日本）を使用して10μmの冠状切片にスライスしました。 凍結切片を PBS で各 3 分間 3 回洗浄し、Blocking One Histo (ナカライテスク、06349-64; 京都、日本) でブロックし、PBS 中の 1% Triton X-100 で 10 分間透過処理し、 PBSで各5分間。 次に、切片を抗 CD31 抗体 (1:50; BioLegend, 160,202; San Diego, CA) および抗 vWF 抗体 (1:50; Cell Signaling Technologies, 65,707; Danvers,マ）。 Alexa Fluor 488 および 647 結合抗体 (Thermo Fisher Scientific、SA5-10327; Cell Signaling Technologies、4416) をそれぞれ抗 CD31 抗体および抗 vWF 抗体の二次抗体として使用し、室温で 2 時間インキュベートしました。 核を DAPI (SeraCare、71-03-01; ミルフォード、アイオワ州、米国) で対比染色しました。 梗塞周囲病変の CD31/vWF 二重陽性細胞は、微小血管を形成する内皮細胞として認識されました 62、68、69、70。 蛍光顕微鏡 BZ-X710 (Keyence Corporation、大阪、日本) を使用して倍率 400 倍で組織学的画像を取得し、CD31/vWF 二重陽性領域を測定しました。 グループあたり 15 の視野 (冠状断面あたり 3 つの重複しないランダム視野、マウスあたり 1 つの冠状断面; 各グループの n = 5) を分析しました。 これらの細胞の面積測定および細胞数は、各視野におけるハイブリッド細胞数計測ソフトウェアBZ-Xアナライザー（キーエンス株式会社）を使用して、各キャプチャ画像内で自動的に実行されました。

細胞移植の 1 か月後、MCAO 後の動物の機能障害と回復を評価するために、行動課題を (補足方法に示されているように) 実行しました [UCB + OP9 グループ (n = 11)、コントロール グループ (n = 11) 、および偽手術グループ（n = 12）]。 同じモデルと行動タスクを使用した以前の研究 71 に基づいて、事前検出力分析により、繰り返し測定された 3 つのグループ間の被験者間の差異を検出する 80% の検出力を得るには、各グループのサンプル サイズが 10 で十分であることが判明しました。オープン フィールド、Y 迷路、および受動的回避学習テストの ANOVA。 行動課題は、実験グループを知らされていない独立した実験者によって実施されました。 異常な多動性は局所性脳梗塞後のマウスモデルで観察され、最長 2 ～ 3 か月続くことが知られています 72,73。これは、異常な不安と、記憶障害による繰り返し曝露後の慣れ障害によって引き起こされます 74。 私たちのモデルでは、MCAO によるこれらの行動異常は、オープンフィールドテストでの移動距離を使用して評価できます39。 筋力と運動耐性は、ワイヤーハングテストで落下するまでの待ち時間によって測定されました。 空間作業記憶と恐怖条件付き感情記憶は、それぞれ Y 迷路 75 と受動的回避学習タスク 76 を使用して評価されました。 最後に、強制水泳テストを使用して、モチベーションの低下と運動耐性を評価しました77。 我々は以前、慢性期（すなわち、MCAO誘導後1〜2か月）におけるY字迷路および受動的回避学習課題のスコアに対するMCAO誘導の影響を確認した71。

すべてのデータは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表され、JMP ver. 1.2 を使用して分析されます。 13 (SAS Institute Inc.、米国ノースカロライナ州ケアリー)。 2 つのグループ間の差異は対応のない両側 t 検定を使用して分析されましたが、3 つ以上のグループまたは繰り返し測定された値の分析は、一元配置 ANOVA または rmANOVA が統計的有意性を示した場合には事後ダネット検定を使用して実行されました。 ダネット検定を実行する場合、対照グループと最初のセッションは、それぞれグループ間の比較と被験者内のセッションごとの違いの分析の対照として設定されました。 統計的有意性は p < 0.05 に設定されました。

著者らは、調査結果の基礎となるすべてのデータが制限なく完全に利用可能であることを確認しています。 現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

scRNA-seq データは、アクセッション番号 GSE207249 で NCBI GEO に寄託されました。

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著者らは博士に感謝します。 ヒト臍帯血の調製については、兵庫医科大学産婦人科の上東真理子氏、田中裕之氏、澤井秀明氏、柴原宏明氏が担当した。 また、FACS 分析装置を含むリソースの使用を許可してくださった兵庫医科大学共同利用研究施設のスタッフに感謝します。 大阪大学微生物病研究所ゲノム情報研究センターNGS中核施設およびGenble Inc.のRNA配列決定とデータ解析のご支援に感謝いたします。

本研究は、JSPS 科研費基盤研究(C) [課題番号 JP22K09221] の助成を受けて行われました。

吉田泰則氏と武田友紀氏も同様に貢献しました。

兵庫医科大学脳神経外科〒663-8501 兵庫県西宮市武庫川1-1

Yasunori Yoshida, Yuki Takeda, Toshinori Takagi, Yoji Kuramoto & Shinichi Yoshimura

兵庫医科大学先端医科学研究所分子細胞治療研究室〒663-8501 兵庫県西宮市武庫川1-1

Kenichi Yamahara & Hanae Yamamoto

〒663-8501 兵庫県西宮市武庫川1-1 兵庫県立医科大学先端医科学研究所神経発生・中枢修復研究室

Akiko Nakano-Doi, Takayuki Nakagomi & Nobutaka Doe

兵庫医科大学リハビリテーション学部作業療法学科〒650-8530 兵庫県神戸市中央区港島1-3-6

Nobutaka Doe

兵庫医科大学血液内科〒663-8501 兵庫県西宮市武庫川1-1

Toshihiro Soma

兵庫医科大学脳疾患治療学教室〒663-8501 兵庫県西宮市武庫川1-1

Tomohiro Matsuyama

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YTは実験を行いました。 YY はデータを分析および解釈し、原稿を作成しました。 HY と AD は実験の実施に多大な貢献をしてくれました。 TN、TS、TM は実験計画とデータ解釈に参加しました。 ND と YK は行動課題の分析に多大な貢献をしました。 TT と KY が原稿を修正しました。 SY は研究の構想と設計に多大な貢献をしました。 KY は YY とともにデータを分析および解釈し、記事の最終版の公開を承認し、作業のあらゆる側面について責任を負うことに同意しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

山原健一氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

吉田 裕也、武田 裕也、山原 和也 他 OP9間質細胞によって刺激された臍帯血の血管新生特性の強化は、脳梗塞マウスモデルにおける神経学的欠損を改善する。 Sci Rep 13、262 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-27424-7

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受信日: 2022 年 9 月 15 日

受理日: 2022 年 12 月 29 日

公開日: 2023 年 1 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27424-7

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