DNA アプタマーを使用した Ag+ イオンの反復検出

Scientific Reports volume 12、記事番号: 9692 (2022) この記事を引用

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この論文では、マイクロ流体加熱システムと統合された DNA アプタマー結合ヒドロゲル生化学センサーを使用した、Ag+ イオンの反復可能な検出について説明します。 化合物に反応して検出可能な信号を生成する生化学センサーは、現代社会の多くの側面で重要な役割を果たしています。 特に、Ag+イオンをはじめとする有害物質などの環境情報を繰り返し測定することで、環境改善が期待できます。 DNA アプタマーは、化学物質への結合の安定性と選択性により、魅力的な候補です。 しかし、これまでのDNAアプタマー生化学センサーは初期化機能を持たなかったため、繰り返し測定することができませんでした。 この課題を克服するために、我々は、Ag+ イオンの反復検出を可能にするマイクロ流体加熱システムと統合された DNA アプタマー結合ヒドロゲル生化学センサーを提案しました。 結合している Ag+ イオンは、統合されたマイクロ流体加熱デバイスを加熱およびフラッシュすることによって解離されます。 DNA アプタマー結合ヒドロゲルは、さまざまな水生生物に対する毒性範囲を含む、広範囲の Ag+ イオン濃度 (10-5 ～ 10 mM) を検出する能力を持っていました。 最後に、Ag+ イオンの繰り返し検出を実証しました。 これらの結果は、私たちが提案する生化学センサーが、周囲温度での高い安定性と低消費電力を備えた長期モニタリングへの使用が期待できることを示しています。

化学物質に反応して検出可能な信号を生成する生化学センサーは、現代社会の多くの側面で重要な役割を果たしています。これは、人間が光、圧力、温度、湿度などの物理的環境よりも化学的または生物学的環境に対してはるかに敏感であるためです1。 たとえば、代謝物、金属イオン、ホルモンなどの人体内の特定の分子は人の健康状態を反映しますが、重金属、爆発物、毒素などの環境中の化学物質は、人間を含む植物や動物に影響を与える可能性があります2、3。 人の健康増進や環境改善のために、こうした生体情報や環境情報を長期間にわたって繰り返し計測することが期待されています。 長期間の再現性測定の実現に向けて、高感度かつ再現性の高い生化学センサーの開発が期待されています。

これまでにさまざまなタイプの生化学センサーが開発されてきました4,5,6,7が、近年、新世代の生化学センサーとして、DNAやRNAなどの核酸を感知素子として用いた機能性核酸センサー1が注目されています。 機能性核酸センサーの中でも、特定の塩基配列を有する一本鎖DNAであるDNAアプタマーは、標的物質に対して高い結合選択性で特異的に結合することから注目を集めている。 これまでに、DNA アプタマーの標的物質としては、血小板由来増殖因子、トロンビン、コカインなどの生体物質や、Ag+ イオン、Hg2+ イオン、Pb2+ イオン、Sr2+ イオンなどの環境有害物質など、さまざまな物質が報告されています 8,9。 さらに、DNA アプタマーは安定した材料です。DNA アプタマーは、結合能力を失うことなく、多くのサイクルにわたって熱変性および再生できます 1。 これらの特性を利用して、さまざまなタイプの DNA アプタマー生化学センサーが開発されています 9,10。 これらの DNA アプタマー生化学センサーのほとんどは、出力として蛍光 11、12、電気化学 13、14、および可視波長 15 信号を使用します。 しかし、これらのDNAアプタマー生化学センサーは、標的分子とDNAアプタマーの結合を解離する機能を持たないため、標的分子を一度しか測定できませんでした。 DNA アプタマー生化学センサーを繰り返し測定するには、DNA アプタマー生化学センサー内の標的分子を解離、除去して DNA アプタマー生化学センサーを初期化する必要があります。

この課題を克服するために、マイクロ流体加熱システムと統合されたDNAアプタマー結合ヒドロゲル生化学センサーを使用して、Ag+イオンを繰り返し検出することを提案します（図1a）。 提案された生化学センサーは、DNA アプタマー結合ハイドロゲル、マイクロ ヒーター、マイクロ チャネルの 3 つのコンポーネントに分かれています。 Ag+イオンに特異的に結合するDNAアプタマー16、17は、アクリルアミドヒドロゲルポリマーネットワークに架橋結合して、Ag+イオンをヒドロゲルの体積変化に変換します（図1b）。 これまでの研究17に基づき、Ag + イオンがDNAアプタマーに結合することにより、ストレート構造からヘアピン構造に変化するDNAアプタマーの配列が明らかになりました（図1c）。 DNA アプタマー結合ハイドロゲルの体積変化は、Ag+ イオンの捕捉による DNA アプタマーの折り畳みによって引き起こされます。 より詳細には、DNAアプタマーの銀を介した塩基対（C-Ag(I)-C）はC残基間に形成され、その構造をヘアピン構造に変化させます（図1c）17。 ヘアピン構造は、架橋ヒドロゲルポリマーネットワークの引きずりを引き起こし、DNA アプタマー結合ヒドロゲルの収縮につながります。 収縮した DNA アプタマー連結ハイドロゲルを繰り返し使用するために、マイクロ流体加熱デバイスによる加熱とフラッシュによって DNA アプタマーに結合している Ag+ イオンが解離され、DNA アプタマー連結ハイドロゲルが初期状態に膨潤することが可能になります。 このメカニズムを利用して、提案された DNA アプタマー結合ハイドロゲル生化学センサーは、ハイドロゲル内の DNA アプタマーが再度 Ag+ イオンを捕捉する能力を有するため、繰り返し Ag+ イオンを検出することができます。 この論文では、DNA アプタマー結合ヒドロゲルの Ag+ イオン応答性の特性を調査し、マイクロ流体加熱デバイスの加熱性能を特徴付けます。 概念実証として、マイクロ流体加熱デバイスと統合された DNA アプタマー結合ヒドロゲル生化学センサーによる反復可能な Ag+ イオン センシングを最終的に実証します。

(a) 化学物質を繰り返し検出するためのマイクロ流体加熱装置と統合された DNA アプタマー結合ヒドロゲル生化学センサーの概略図。 (b) DNA アプタマー連結ハイドロゲルは、Ag+ イオンを捕捉した DNA アプタマーのヘアピン構造の形成により体積が変化します。 (c) Ag-DNA アプタマーは、Ag+ イオンの結合と解離によって可逆的に構造が変化します。

DNA アプタマー結合ハイドロゲル生化学センサーでは、アクリルアミド ハイドロゲルの 2 つの特徴、すなわち周囲温度 (4 ～ 100 °C) での安定性と、環境温度 (4 ～ 100 °C)18 に対する非応答性という 2 つの特徴により、DNA アプタマーを固定するポリマー ネットワーク材料としてポリアクリルアミドが使用されました。 Ag+イオン。 Ag+ イオンは水性環境における毒性を調べるための一般的な指標であるため、Ag+ イオン DNA アプタマー (図 1c) を選択しました 3。 DNA アプタマーの末端はメタクリル酸 N-スクシンイミジル エステルで修飾され、アクリルアミド ネットワークと架橋されています。 DNA アプタマー センサーを作製するには、プレゲル溶液 (0.20 g/mL アクリルアミド、架橋剤として 0.133% (w/w) N,N'-メチレンビス (アクリルアミド)、架橋剤として 0.5% (v/v) Irgacure1173光開始剤、および Ag+ イオン DNA アプタマー (プレゲル溶液中 0、40、400 μM)) をポリジメチルシロキサン (PDMS) 型 (直径: dm = 3 mm、厚さ: t = 0.5 mm または直径) に注入しました。厚さ：dm = 2 mm、厚さ：t = 0.3 mm）をUV照射により架橋させます。 最後に、作製した DNA アプタマー結合ハイドロゲルを 3 時間かけて純水中に置き、周囲の純水を吸収して膨潤させました。

まず、DNA アプタマー結合ハイドロゲルの Ag+ イオンに対する収縮挙動を検証しました。 直径 3 mm、厚さ t = 0.5 mm のモールドを使用した場合、作製した DNA アプタマー結合ハイドロゲル dgel の直径は 4.6 mm でした（図 2a 左）。 DNA アプタマー結合ハイドロゲルを CH3COOAg 溶液に浸漬して 10 mM Ag+ イオンを適用すると、DNA アプタマー結合ハイドロゲル (DNA アプタマー: プレゲル溶液中 400 μM) が収縮することに成功しました (図 2a 右)。 一方、純粋なアクリルアミドヒドロゲル (DNA アプタマーなし) は、どの濃度の Ag+ イオンにも反応しませんでした (図 2b、白い四角)。 これらの結果は、ハイドロゲルの収縮が DNA アプタマーによって引き起こされることを示しました。 このことから、DNAアプタマーはAg+イオンに特異的に結合し、ヘアピン構造に構造変化したものと考えられる。

(a) 10 mM Ag+ イオンを適用したときの DNA アプタマー結合ハイドロゲルの体積変化。 スケールバーは500μmです。 (b) DNA アプタマー結合ハイドロゲルの収縮率と Ag+ イオン濃度の変化の関係。 (c) 異なる Ag+ イオン濃度における収縮率 ε の時間変化。 (d) 異なるサイズの DNA アプタマー結合ハイドロゲルの収縮率 ε の時間変化。 (e) 環境サンプル中の Ag+ イオンの検出。

次に、Ag+イオン濃度がDNAアプタマー連結ヒドロゲルの収縮率に及ぼす影響を観察するために、適用するAg+イオン濃度を10-5から10mMまで変化させた。 DNA アプタマー結合ハイドロゲルは等方的に収縮した 19。 収縮率εは次のように定義されました。

ここで、A0は応答前のDNAアプタマー結合ハイドロゲルの面積、A(t)は応答時間tにおけるDNAアプタマー結合ハイドロゲルの面積である。 異なる DNA アプタマー密度 (プレゲル溶液中の 40 μM および 400 μM DNA アプタマー) の DNA アプタマー結合ハイドロゲルの収縮率は、Ag + イオン濃度が増加するにつれて増加しました (図 2b、灰色の四角および灰色の三角)。 高密度 DNA アプタマーを含むハイドロゲル（ゲル前溶液中 400 μM）は、体積が大きく変化しました（10 mM Ag+ イオンで ε = 0.84、体積変化率: 0.77）（図 2b、灰色の四角）。低密度 DNA アプタマー (プレゲル溶液中 40 μM) は体積をわずかに変化させました (10 mM Ag+ イオンで ε = 0.95、体積変化率: 0.93) (図 2b、灰色の三角形)。 これらの結果は、DNA アプタマー結合ハイドロゲルが Ag+ イオン濃度の測定に適用できること、および DNA アプタマー結合ハイドロゲル生化学センサーの感度がハイドロゲル中の DNA アプタマーの量に応じて調整できることを示しました。

次に、適用した Ag+ イオン濃度 (60 mM、6 mM、または 0.6 mM) による DNA アプタマー結合ハイドロゲルの応答速度を調べました。 60 mM Ag+ イオン、6 mM Ag+ イオン、および 0.6 mM Ag+ イオンの両方を適用すると、DNA アプタマー結合ハイドロゲルの体積が徐々に変化し、体積変化は約 1 時間で収束しました (図 2c 赤い四角と青い四角、動画) 1)。 データ解析ソフト（IGOR Pro、WaveMetrics）を用いて、プロットした収縮率εを指数関数で近似し、その指数関数の時定数τを算出し、結合したDNAアプタマーの応答速度を比較した。ハイドロゲルセンサー。 時定数 τ は、16.3 分 (60 mM Ag+ イオン、図 2c の赤い四角)、11.4 (6 mM Ag+ イオン、図 2c の緑の四角)、および 18.6 分 (0.6 mM Ag+ イオン、図 2c の赤い四角) とほぼ同じでした。 .2c青い四角）、収縮率は大きく異なりました（60 mM Ag+ イオン：ε = 0.62、6 mM Ag+ イオン：ε = 0.68、0.6 mM Ag+ イオン：ε = 0.77）。 これらの結果は、DNA アプタマー結合ハイドロゲルの応答速度が Ag+ イオン濃度によって支配的に影響を受けないことを示しています。

次に、DNA アプタマー結合ハイドロゲルの直径を変化させることにより、表面積対体積比 (Rs,v) の影響を観察しました。 異なる直径（dgel = 2.7 mmおよび4.6 mm）のDNAアプタマー結合ヒドロゲルを、異なるサイズの金型（dm = 2 mm、t = 0.3 mm、Rs,v = 8.67およびdm = 3 mm、t = 0.5 mm）を使用して作製しました。 、Rs,v = 5.33)、10 mM Ag+ イオンを適用しました。 DNA アプタマー結合ヒドロゲルの直径は、それぞれ 2.7 から 2.5 mm (ε = 0.88、図 2d の青い四角) と 4.6 から 4.2 mm (ε = 0.84、図 2d の赤) に減少しました。 小さい DNA アプタマー結合ハイドロゲル (dgel = 2.7 mm、Rs,v = 8.67) の時定数は、大きい DNA アプタマー結合ハイドロゲル (dgel = 4.6 mm、Rs,v = 5.33) よりも速かった (τ = 3.9 分)。 、τ = 19.0 分）。 これらの結果から、DNAアプタマー連結ハイドロゲルの収縮率を低下させることなく表面積対体積比を増加させることにより、応答速度が向上することが示された。

次に、環境サンプル中の Ag+ イオンの検出を観察しました。 環境サンプルは水槽と河川から入手されました（裏付け情報 S1、図 S1）。 DNA アプタマー結合ヒドロゲル (プレゲル溶液中の 400 μM DNA アプタマー) を、追加の 10 mM Ag+ イオンの存在下または非存在下で環境サンプルに 2 時間かけて浸漬しました。 DNA-アプタマー結合ヒドロゲルは、水槽のサンプル中の複数のイオンに応答してε = 0.76で収縮しました（図2e、赤枠バー）。 10 mM Ag+を含む水槽のサンプルに浸漬すると、DNA-アプタマー結合ヒドロゲルはε = 0.65で大きく収縮しました（図2e、赤いバー）。 水槽のサンプルと同様に、川のサンプルを 10 mM Ag+ イオンに浸すと、DNA アプタマー結合ヒドロゲルは大幅に収縮しました（コントロール：ε = 0.64、10 mM Ag+ のサンプル：ε = 0.59、図 2e 青）バー）。 これらの結果は、DNA アプタマー結合ハイドロゲルが周囲環境の複数のイオンの影響を受けていることを示しています。 しかし、本研究で提案された DNA アプタマーは、Ag+ イオンに特異的に結合してヘアピン構造を形成し、DNA アプタマー結合ハイドロゲルの大幅な収縮につながります (裏付け情報 S2、図 S2)15。 実際、Ag+ イオンがある場合とない場合では、DNA アプタマー結合ハイドロゲルの収縮率には明らかな違いがあります。 したがって、提案したセンサは、収縮挙動の違いを測定することにより、周囲環境中のAg+イオンを検出することができます。

DNA アプタマーからの Ag+ イオンの解離温度は、融解温度 Tm から推定されます。 DNA アプタマーは、Ag+ イオンを捕捉する際に 5 つの AT 塩基対と 5 つの C-Ag(I)-C ペアを持ちます。 Wallace 法および以前の研究 16 では、DNA 二重鎖の融解温度は AT 塩基対 (Tm、AT) ごとに 2 °C、C-Ag(I)-C ペア (Tm、CAgC) ごとに 8 °C 上昇します。それぞれ。 したがって、融解温度 Tm は次のように計算できます。

DNAアプタマー結合ヒドロゲルをAg+イオンの解離のために融解温度まで加熱するために、マイクロ流体加熱デバイスを作製しました（図3a左）。 マイクロ流体加熱デバイスは、マイクロ ヒーターとマイクロ チャネルの 2 つの主要なコンポーネントに分かれています。 パターン化されたAu層（厚さ：〜175 nm、幅：1 mm、図S3a）で作られたマイクロヒーターは、電流を流すことによって発生するジュール熱によってマイクロ流路を流れる水溶液を加熱できます（図S3a）。 3a右）。 マイクロ流路（幅：3 mm、高さ：1 mm）には、DNAアプタマー結合ハイドロゲルを流れ中に固定するためのゲル保持チャンバー（直径：7 mm、高さ：1.5 mm）があります（図S3b）。 注入口からゲル保持チャンバーまでの距離は１５ｍｍであった。

(a) 繰り返し検出するために DNA アプタマー結合ヒドロゲルを初期化するためのマイクロ流体加熱デバイスの概略図と画像。 スケールバーは1 mmです。 （b）DI水を供給し、マイクロヒーターで加熱したときのマイクロ流体加熱装置のサーモグラフィ画像。 スケールバーは5mmです。 (c) 流入口からの距離とマイクロ流路の温度の関係。 スケールバーは5mmです。 (d) ゲル保持チャンバーの経時的な温度測定。 スケールバーは5mmです。

次に、作製したマイクロ流体加熱装置の特性を調べた。 ＤＩ水を一定流量（５μＬ／ｓ）でシリンジポンプを使用してゲル保持チャンバーに供給し、供給されたＤＩ水をマイクロヒーター（電流：０．３５Ａ）で加熱した。 加熱の開始時（5 秒）、ゲル保持チャンバーの上部はまだ低温でした（< 30 °C、図 3b 左）。 50 秒間脱イオン水を加熱した後、チャンバーの上部は 50 °C 以上に加熱されました (図 3b 右)。 温度分布を測定することにより、マイクロチャネルの温度は入口からゲルチャンバーに向かって徐々に上昇し、ゲル保持チャンバーの温度は約70℃に達しました（図3c）。 さらに、経時的な温度測定により、ゲルチャンバーの上部の温度が約40秒で50℃に到達することが示されました（図3d）。 その後、ゲル保持室の温度は７０℃に収束した。 これらの結果は、ゲルチャンバーに配置された DNA アプタマー結合ハイドロゲルを、作製したマイクロ流体加熱デバイスを使用することによって、DNA アプタマー結合ハイドロゲルの融解温度 Tm = 50 °C 以上に加熱できることを示しました。

最後に、DNA アプタマー結合ハイドロゲルによる Ag+ イオンの繰り返し検出が検証されました。 DNA アプタマー結合ヒドロゲル (400 μM) は、10 mM Ag+ イオンに対する最初の応答で、収縮率 ε = 0.74 で収縮しました (図 4 の青いプロット)。 次に、DNA アプタマー結合ハイドロゲルで捕捉された Ag+ イオンを 120 分間加熱およびフラッシング (脱イオン水の流量: 1 μL/s、電流: 0.30 A) することによって解離させ、センサーを初期化しました。 マイクロヒーターの温度が上昇するにつれて、印加電圧も増加した。 したがって、印加電流（0.30 A）と収束後の電圧（6.9 V）を用いて、マイクロ流体デバイスの消費電力は2.07 Wと計算されました。初期化されたDNAアプタマー結合ハイドロゲルは膨潤し、収縮率εは回復しました。から 0.92 (図 4、赤いプロット)。 DNAアプタマー連結ハイドロゲルが初期状態まで完全に膨潤しなかった理由は、DNAアプタマーの折り畳みに引きずられてアクリルアミドハイドロゲルのネットワークが塑性変形したためと考えられる。 続いて、DNAアプタマー結合ハイドロゲルを10 mM Ag+イオンに応答させ、加熱とフラッシュを繰り返すことで解離させた。 2 回目と 3 回目の応答の収縮率は ε = 0.74 および ε = 0.75 (図 4 青色のプロット) であり、1 回目の応答とほぼ同じ値であり、DNA アプタマー結合ハイドロゲルの応答性は 1 回でも維持されていることがわかります。繰り返しの返答の後。 2回目の初期化では、DNAアプタマー結合ハイドロゲルの収縮率もε=0.93まで回復し、これも1回目の初期化と同じ値でした（図4赤プロット）。 したがって、これらの結果は、マイクロ流体加熱デバイスと統合された私たちの提案した DNA アプタマー結合ヒドロゲル生化学センサーが Ag + イオンを繰り返し検出できることを示しました。

DNA アプタマー結合ハイドロゲル生化学センサーを使用した Ag+ イオンの反復検出。

私たちが提案した、マイクロ流体加熱デバイスと統合された DNA アプタマー結合ヒドロゲル センサーは、Ag+ イオンに対する反復応答の能力を示しました。 これは、ジュール加熱による初期化による DNA アプタマー結合ヒドロゲル生化学センサーの反復可能な測定のために最初に提案された概念です。 銀イオンは敏感な水生生物に有害です。水環境中の 1 ～ 5 µg/L の Ag+ イオンは、昆虫、ミジンコ、端脚類、マス、ヒラメ、ウグイの代表的な種を含む、敏感な水生生物の種を殺しました。 100 ～ 401 µg/L の Ag+ イオンは、ホタテ貝、カタツムリ、ニジマスなどのさまざまな海洋動物を殺しました。 3000 µg/L の Ag+ イオンが海洋細菌を死滅させます3。 DNA アプタマー結合ヒドロゲルの収縮挙動は、環境サンプル中の複数のイオンによってわずかに影響を受けました 15、20、21。 しかし、提案されているDNA-アプタマー結合ハイドロゲルはAg+イオンと特異的に結合し、大きな収縮を引き起こすことも明らかになった。 提案された DNA アプタマー結合ハイドロゲルは、収縮挙動を比較することで環境サンプル中の Ag+ イオンを検出できます。 したがって、提案した再現性のある生化学センサは、持続可能な社会の実現に必要な長期的な水質モニタリングに応用できる可能性がある。

提案したセンサの初期化は、長期使用に有効な低消費電力（約 2.07 W）によって実証されました。 提案されたセンサーのセンシングターゲットに関しては、DNA アプタマー配列のバリエーションのおかげで、さまざまなタイプのターゲットを受け入れることができます 8、9、22。 さらに、センサーの感度と応答速度は、ハイドロゲル内の DNA アプタマーの密度とハイドロゲル全体の大きさによって、それぞれセンシング対象に応じて調整できます。

本稿ではハイドロゲルの体積変化を手動で計測しているため、提案するDNAアプタマー連携生化学センサーの実用化には、マイクロ流体加熱装置内のハイドロゲルの直径を取得できる自動体積計測システムが必要である。 たとえば、相補型金属酸化膜半導体 (CMOS) イメージ センサーは、安定していて安価であり、デバイスの内部状態を光学的に監視するためにマイクロ流体デバイスに簡単に取り付けられるため、魅力的な候補となっています 23。 さらに、DNAアプタマー結合ハイドロゲルの体積変化を、目に見える色の変化など他の情報に変換することも実用化につながる可能性がある。 例えば、体積変化を可視波長変化に変換できるフォトニックコロイド結晶は、ハイドロゲル中で作製できるため、DNAアプタマー結合ハイドロゲルとの一体化も期待されている15,21,24,25。 センシング対象に関しては、DNA アプタマー連結ハイドロゲルは、DNA アプタマーを変更することで重金属イオンなどの他の対象にも応答できます 8,20,21。 DNA アプタマーと標的物質の結合の基本原理は同じであるため、本研究で提案されているマイクロ流体加熱デバイスによるフラッシングは、他の DNA アプタマー結合ヒドロゲルにも適用できます。 融解温度 Tm は、結合する塩基対の数や、標的物質と塩基対の結合力によって異なりますが、式(1)のように推定できます。 (2)。 提案されたマイクロ流体加熱デバイスは、電流を調整することで任意の熱刺激を加えることができるため、異なるDNAアプタマーを結合したDNAアプタマー結合ハイドロゲルも標的物質を繰り返し検出することができます。 これらの改善により、私たちが提案する DNA アプタマー ベースのヒドロゲル センサー システムを使用して、身体または環境からの化学物質の繰り返し検出を完全に自動化できると考えています。

我々は、マイクロ流体加熱システムと統合された DNA アプタマー結合ハイドロゲル生化学センサーを使用することにより、Ag+ イオンを繰り返し検出することを提案しました。 DNA アプタマー結合ヒドロゲル生化学センサーは、さまざまな水生生物の毒性範囲を含む広範囲の Ag+ イオン濃度 (10-5 ～ 10 mM) を検出できます。 私たちが提案した DNA アプタマー結合ヒドロゲル生化学センサーは、マイクロ流体加熱デバイスによる加熱とフラッシュによって Ag+ イオンを 3 回検出できました。 DNA-アプタマー結合ハイドロゲルは広い温度範囲（4～100℃）に対して安定であるため、私たちが提案する生化学センサーは、周囲温度での高い安定性と低消費電力を備えた長期モニタリングへの使用が期待されます。 また、将来的には、私たちが提案するDNAアプタマー結合ハイドロゲル生化学センサーは、DNAアプタマーの配列を調整することで、体内や環境中のさまざまな標的を検出するために応用できる可能性も期待されています。

プレゲル溶液 (0.20 g/mL アクリルアミド (和光、012-00762) + 0.133% (w/w) N,N'-メチレンビス (アクリルアミド) (クロスリンカー、和光、018-03282) + 0.5% ( v/v) Irgacure 1173 (光開始剤、BASF、30472687) + Ag+-イオン DNA アプタマー (アプタマー配列: CH2=C(CH3)–C(=O)–NH-5'-CTCTCTTCTCAAA-AAACACAACACAC-3'-NH– DNA アプタマー結合ハイドロゲルの作製には、C(=O) –C(CH3)=CH2、0、40、400 μM のプレゲル溶液、つくばオリゴサービスで合成）を使用しました。 PDMSモールド（直径：dm = 3 mm、厚さ：t = 0.5 mm、または直径：dm = 2 mm、厚さ：t = 0.3 mm、基材：硬化剤 = 10:1、東レ、シルポット184）およびPDMSモールドをガラス板 (22 × 22 mm、No.1、松浪) で覆い、PDMS モールド内のプレゲル溶液を UV 照射により架橋し、DNA 溶液の電解質を脱イオン水で置換しました。作製した DNA アプタマー結合ハイドロゲルを 8 mL の脱イオン水に 3 時間浸漬し、3 回洗浄しました。

マイクロ流体加熱装置はマイクロヒーター部とマイクロチャネル部に分かれていた。 マイクロヒーター部分は以下のプロセスで作製しました（設計詳細はサポート情報に記載）。 クロム (Cr: ~ 5 nm) と金 (Au: ~ 175 nm) 層を真空蒸着装置 (VE-2012、真空装置) によってガラス基板 (S9111、松浪) 上に接着層およびマイクロヒーターとして蒸着しました。それぞれワイヤ層。 マイクロヒーターパターンの微細パターニングのために、Cr/Au 蒸着基板を 100 °C で 2 分間プリベークし、続いてポジ型フォトレジスト (OFPR-800-20CP、東京応化工業) を 100 ℃ でスピンコートしました。 2000 rpm、100 °C で 4 分間ベークします。 マスクアライナー（EMA-400、Union）を使用して、フォトマスクを通してフォトレジストでコーティングされた基板にUVを照射しました。 UV 照射後、フォトレジスト層を NMD-3 (2.38% 水酸化テトラメチルアンモニウム、東京応化工業) で現像し、残留フォトレジストを O2 プラズマ アッシング (SEDE-P、メイワフォシス) で 10 秒間除去しました。 露出したＣｒ／Ａｕを、それぞれＡｕエッチャント（０．２Ｍ ＫＩ＋０．０３３Ｍヨウ素溶液；ＫＩ：１６４－０３９７２、和光；ヨウ素溶液：０９４－０１７０５、和光）およびＣｒエッチャント（Ｋａｔｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によりエッチングした。 ＤＩ水で２回洗浄した後、フォトレジスト層をアセトン（０１３−００３５６、Ｗａｋｏ）で除去し、続いてエタノール（０５７−００４５６、Ｗａｋｏ）ですすぎ、３０秒間のＯ２プラズマ洗浄によって除去した。 マイクロヒーター部への配線は、Cu線（2UEW0.26mm、協和ハーモネット）を導電性ペースト（No Solder、エレファンテック）を介してAuパターンに接続しました。 最後に、Cytop (CTL-809 M、AGC 化学薬品) を、絶縁のために Au エッチングした基板上に 1000 rpm でスピンコートし、その後 180 °C で 2 時間ベークしました。

次に、マイクロ流路の作製（詳細設計はサポート情報に記載）として、PDMS（主剤：硬化剤＝10：1）をアクリルモールドに流し込み、75℃で2時間加熱して硬化させました。 。 作製したマイクロチャネル部はパンチバイオプシー（カイメディカル社製、φ1mm、BP-10F）により入口を開けた後、ヒーター部上に設置した。 注入口をテフゼルチューブ（VICI、1/16インチ×0.5 ETFE）を介してシリンジポンプ（KD Scientific、LEGATO 180）に接続した。

DNAアプタマー結合ハイドロゲルを倒立位相差顕微鏡(OLYMPUS、IX73P1-22FL/PH)で観察した。 Ag+ イオンに対する応答を観察するために、DNA アプタマー結合ヒドロゲルを 1 μM ～ 10 mM 酢酸銀溶液 (CH3COOAg) に 120 分間浸漬しました。 応答速度の比較は、データ解析ソフト（IGOR Pro、WaveMetrics）を用いて、プロットした収縮率εを指数関数で近似し、その指数関数の時定数τを計算して応答速度を比較しました。 DNAアプタマー結合ハイドロゲルセンサーの開発。

環境条件中の Ag+ イオンを検出するために、環境サンプルを水槽と川から入手しました。 DNA アプタマー結合ヒドロゲル (DNA アプタマー: プレゲル溶液中 400 μM) を、10 mM Ag+ の存在下または非存在下で環境サンプルに浸漬しました。

マイクロ流体加熱装置のマイクロヒーター機能を調べるために、電源（PS40-20A、TEXIO）によりマイクロヒーター部分に電流（0.35 A）を印加しました。 ＤＩ水をシリンジポンプによりマイクロチャネル部に５μＬ／秒で導入した。 マイクロチャネルの温度は、サーモグラフィーカメラ（ETS320、FLIR）によって測定されました。

DNAアプタマー結合ハイドロゲルを用いた再現性のある検出のために、以下の3つのプロセスを3回繰り返しました。 まず、DNA アプタマー結合ハイドロゲル (DNA アプタマー: プレゲル溶液中 400 μM) を 10 mM CH3COOAg 溶液に 120 分間浸漬することで Ag+ イオンに応答しました。 次に、DNA アプタマー結合ヒドロゲルをマイクロ流体加熱システム (DI 水の流量: 1 μL/s、電流: 0.30 A) で 120 分間加熱およびフラッシュして、Ag+ イオンを解離させました。 最後に、DNA アプタマー結合ヒドロゲルを脱イオン水 (20 °C) 中で 120 分間冷却しました。

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日本学術振興会（JSPS）の挑戦的な研究（萌芽）（20K21828）および挑戦的な研究（開拓）（21K18164）。

これらの著者、吉田幸樹氏と林智樹氏も同様に貢献しました。

慶応義塾大学大学院総合デザイン工学研究科〒223-8522 横浜市港北区日吉3-14-1

Koki Yoshida, Tomoki Hayashi & Hiroaki Onoe

慶応義塾大学理工学部機械工学科〒223-8522 横浜市港北区日吉3-14-1

Hiroaki Onoe

〒226-8502 横浜市緑区長津田町4259 東京工業大学 情報理工学院 情報工学科

滝ノ上正博

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KY と TH は同等に貢献しました。 TH と HO が研究を設計しました。 MTはDNAアプタマーの設計や修飾に貢献します。 KYとTHが実験を行いました。 KYとHOが原稿を書きました。 すべての著者が原稿の最終版を承認しました。

尾上宏明氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足ビデオ1.

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転載と許可

吉田和也、林達也、滝ノ上正人 他マイクロ流体加熱システムと統合された DNA アプタマー結合ハイドロゲル生化学センサーを使用した Ag+ イオンの反復検出。 Sci Rep 12、9692 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-13970-z

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受信日: 2021 年 12 月 7 日

受理日: 2022 年 5 月 31 日

公開日: 2022 年 6 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13970-z

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