SOD1(G93A)マウスの皮質グリアはALSによって微妙に影響を受ける

Scientific Reports volume 13、記事番号: 6538 (2023) この記事を引用

868 アクセス

15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

筋萎縮性側索硬化症 (ALS) におけるグリアの役割は否定できません。疾患に関連したそれらの活動は、脊髄では広く研究されていますが、脳では部分的にしか研究されていません。我々はここで、ALS の広く使用されているモデルである SOD1(G93A) マウスの皮質におけるグリアの包括的な研究を紹介します。単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) と免疫組織化学を使用して、性因子を考慮して、病気の 4 つの段階でアストロサイト、ミクログリア、希突起膠細胞を検査しました。私たちは、性別に関係なく、病気の進行全体を通じてグリアの変化が最小限であることを報告しています。疑似バルクおよび単一細胞分析により、ミクログリアおよび希突起膠細胞における最終段階での疾患に関連した微妙な転写変化が明らかになり、これは免疫組織化学によって裏付けられました。したがって、我々のデータは、SOD1(G93A)マウス皮質が患者の疾患を再現しないという仮説を支持しており、皮質ALS病理の将来の研究には別のモデルの使用を推奨します。

ALS の特徴的な運動ニューロン (MN) の変性は、最初に進行性の筋萎縮を引き起こし、最終段階では運動、会話、嚥下困難、および呼吸不全につながります。一般に、ALS は、病理学的メカニズムがほとんど理解されておらず、生存期間中央値が 3 ～ 5 年である多因子疾患であると考えられています。現在のところ、治療法や予防法はなく、対症療法のみが行われています。

MN は病理の影響を受ける主要な細胞タイプとして認識されていますが、グリアなどの非神経細胞も変化を受けて ALS の進行に関与していることが複数の研究で確認されています 1,2。グリア細胞は、さまざまなメカニズムによって神経変性または損傷に反応します。ミクログリアとアストロサイトは、遺伝子発現と形態の変化を特徴とする、いわゆる反応性状態を獲得します。炎症経路および抗炎症経路の活性化により、組織をさらなる損傷から保護します。しかし、病気の慢性段階では、それらは有害な影響を及ぼし、神経変性の進行に寄与します。従来、反応性アストロサイトとミクログリアは、それぞれ A1 と A2、または M1 と M2 サブタイプに分類されていました。しかし、最近、特定の遺伝子シグネチャーを持つグリアのさまざまな亜集団がさまざまな疾患モデルで記載されているため、この用語は現在では時代遅れであると考えられています 3,4,5。疾患関連アストロサイト (DAA)、疾患関連ミクログリア (DAM)、活性化応答ミクログリア (ARM)、およびインターフェロン応答ミクログリア (IRM) は、これらのほんの数例です。一方、希突起膠細胞は病理学的変化の影響を受けやすくなります。病気に反応すると、反応性状態に変化するのではなく、変性する傾向があります。しかし、最近、免疫防御、インターフェロンシグナル伝達、抗原プロセシングと抗原提示へのそれらの寄与を説明する研究により、疾患の進行におけるそれらの受動的な役割に疑問が投げかけられています6,7。

アストロサイト、ミクログリア、希突起膠細胞の役割、およびそれぞれの病理関連変化は、ALS 患者において何度も報告されています 8、9、10。利用可能なデータの大部分は脊髄からのものですが、いくつかの研究では皮質のグリア病変も報告しています11。既知の病理学的変化はほとんどが死後組織で確認されており、これでは病気のメカニズムを研究することができず、信頼できる動物モデルの必要性が高まっています。現在、SOD1(G93A) マウスは、家族性 ALS12 に似た最も広く使用されているモデルです。表現型的には、このモデルは疾患の経過と一致しており、脊髄と脳幹の研究では、以前に患者で見つかった ALS 関連の細胞変化が報告されています 2,8,13,14,15,16。しかし、皮質については議論の余地があるようだ。研究の数は限られており、結果は矛盾した結果を示唆しています。皮質グリア細胞と MN が ALS 様表現型の影響を受けることを示す研究者もいます 17、18、19、20 が、SOD1(G93A) モデルの皮質領域には影響を及ぼさないと報告する研究者もいます 21。

この研究では、SOD1(G93A) マウスの皮質における SOD1 グリアの病理についての包括的な洞察を提供することを目的としました。 scRNA-seq や免疫組織化学などの堅牢でハイスループットな方法を組み合わせて、行動検査によって特徴づけられる疾患の全経過中に、アストロサイト、ミクログリア、希突起膠細胞を分析しました。 scRNA-seq は、個々のグリア細胞の転写変化を経時的に監視し、特に疾患に関連する部分集団に焦点を当てて異なるグリア集団の構成を調査するために使用されました。皮質病理の特徴付けを完了するために、免疫組織化学を使用してグリア細胞の形態学的および量的変化を評価し、標準的なタンパク質マーカーを測定しました。

すべての実験では、高レベルのヒト SOD1(G93A) (JAX 系統: 004435 C57BL/6 J-Tg (SOD1*G93A)1Gur/J) を発現するトランスジェニックマウスとその非キャリア同腹子を使用しました 12。この株には約 25 コピーの導入遺伝子が含まれており、その 50% 生存期間は 157 ± 9.3 日です (https://www.jax.org/strain/004435)。すべての実験プロトコルはチェコ共和国動物管理委員会によって承認されました (承認番号 40/2019)。動物を使用するすべての方法は、欧州共同体評議会指令 (86/609/EEC) に従って実行されました。実験に使用されたすべての動物は、ペントバルビタールを使用して屠殺され、その後断頭されました。病気の進行段階のため、突然変異マウスは生後 5 か月に達した直後に二酸化炭素を使用して安楽死させられました。苦痛と使用される動物の数の両方を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。この研究はARRIVEガイドラインに従って報告されています。

疾患全体にわたる筋力、機能、および協調性を評価するために、ワイヤーグリッドハングテストとロータロッドテスト（Mouse RotaRod NG 47650、Ugo Basile、イタリア）を実施しました。症状進行の追加パラメーターとして体重も測定されました。テストは、毎週 1 回の 3 回の試行セッションで構成され、P30 から始まり、14 週間続きました。実験の前に、すべての動物は訓練を行いました。データは、n 匹の動物の平均値または平均値±平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。 Holm-Sidak の多重比較補正を備えた反復測定二元配置分散分析を使用して、グループ間の差異を分析しました。

マウスを特注のワイヤー蓋の上、木片で覆われた底部から約 60 cm 上に置き、裏返した。落下までの待ち時間を測定した。テスト期間の開始時に、各マウスを少なくとも 180 秒間連続 3 回訓練しました。実験セッションでは、マウスは蓋につかまる試みを 3 回行いました。 3 つのうちの最高スコアが 180 秒であることに注目しました。

マウスを、回転方向と反対を向いた固定ロッド上に置きました。ロッドは 15 rpm の一定速度で回転を開始し、落下するまでの時間を測定しました。各マウスを、5、10、および15 rpmの速度で少なくとも180秒間連続3回訓練した。実験セッションでは、マウスはロッドの上に留まろうと 3 回試みました。 3 つのうちの最高スコアが 180 秒であることに注目しました。

免疫組織化学的分析のために、動物をＰＴＢ（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で深く麻酔し、２０ｍｌの生理食塩水で経心的に灌流し、続いて２０ｍｌの冷却した０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流し、断頭した。脳および脊髄を切除し、PFAで一晩後固定し、凍結保護のためにスクロース勾配(10〜30%の範囲)で処理した。厚さ 30 μm の冠状スライスをクライオスタット (Leica CM1850、Leica Microsystems、Wetzlar、ドイツ) を使用して調製しました。

免疫組織化学的染色では、切片をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、続いてリン酸緩衝食塩水中の5% Chemiblocker (Millipore, Billerica, MA)および0.2% Tritonで非特異的結合部位をブロックした。ブロッキング溶液は抗血清の希釈剤としても使用されました。スライスを一次抗体とともに一晩インキュベートし、二次抗体を 4 ～ 8 °C で 2 時間適用しました。

以下の一次抗体を使用しました：ウサギ抗アルデヒドデヒドロゲナーゼ 1 ファミリー、メンバー L1 (ALDH1L1 1:500; Abcam、ケンブリッジ、英国)、ラット抗ミエリン塩基性タンパク質 (MBP、1:500、Biorad、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国) )、ウサギ抗コリンアセチルトランスフェラーゼ (ChAT、1:200、Merck、ダルムシュタット、ドイツ)、ウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター分子 1 (Iba-1、1:500、Abcam、ケンブリッジ、英国)、ウサギ切断カスパーゼ-3 (CC3、1:50、CellSignaling、マサチューセッツ州、米国) および大腸腺腫性ポリポーシス (APC、1:200、Merck、ダルムシュタット、ドイツ)。二次抗体は、Alexa Fluor 488 と結合したヤギ抗ウサギ IgG またはヤギ抗マウス IgG、および Alexa Fluor 488 と結合したニワトリ抗ラット IgG (1:500、Invitrogen、Waltham、MA、US) でした。細胞核は、DAPI 染色 (Merck、ダルムシュタット、ドイツ) によって視覚化されました。免疫組織化学分析には、Ar/HeNe レーザーと×40 水対物レンズまたは×63 油対物レンズを備えた Zeiss LSM 880 Airyscan 共焦点顕微鏡を使用しました。

すべての分析は、FIJI 画像処理ソフトウェア (ImageJ 2.9.0/1.53t)22 を使用して行われました。共焦点画像 (212 × 212 × 30 μm) は、一次および二次運動皮質および一次体性感覚皮質の領域 (半球あたり 5 ～ 6 つのゾーン) をカバーする脳冠状スライス (ブレグマから 1 mm および 2 mm) から撮影されました。

ALDH1L1 蛍光強度を定量化するために、各グループに 6 匹の動物と各動物からの 2 つのスライスを使用しました。バックグラウンドを除去するために、しきい値法 (Yen 法) が使用されました。各動物の閾値に限定された平均積分密度を計算しました。

ミクログリアの形態変化を定量化するために、Sholl 解析プラグイン 23 を使用して IBA1 陽性細胞に対して Sholl 解析を実施しました。グループには6匹の動物を使用し、各動物から2枚の脳スライスを使用しました。各脳スライスについて、少なくとも 8 個の細胞が分析されました。 Sholl 解析では、連続した Z スタックイメージが最大強度投影に変換され、バイナリマスクを作成するために投影が閾値処理されました。我々は、体細胞の中心から５μｍから開始して半径ステップサイズ５μｍで交差点の数を数えた。

APC および CC3 陽性細胞を定量するために、各グループから 3 匹の動物と、各動物からの 1 つのスライス (ブレグマから 1 mm) を分析に使用しました。 APCまたはCC3陽性細胞の数を重ね合わせた画像から決定し、DAPI + 細胞の総数からのマーカー発現細胞の割合として表しました。次に、アポトーシス細胞のパーセンテージを、以前に計数した APC + 細胞に対する CC3 + の比率として表しました。

MBP染色の分析には、60倍の油対物レンズを備えたOlympus FV10i共焦点顕微鏡を使用しました。各グループに 6 匹の動物と各動物に 2 つのスライスを使用し、各半球あたり 12 のゾーンをスキャンしました。 MBP 発現密度は、カスタム作成された FIJI (ImageJ) マクロ (https://github.com/jakubzahumensky/JT_paper で入手可能) を使用して決定されました。簡単に言うと、分析された画像の次元を等しく保つために、マクロは各 Z スタックから最も明るい 20 フレームのサブスタックを抽出しました。続いて、各フレーム内のファイバーのバイナリマスクを作成し、マスクでカバーされるフレーム部分を測定しました。各サブスタック内でこの値の平均が計算され、繊維が占める体積分率が得られます。グループ間の差異の統計分析は、対応のない t 検定を使用して実行されました。プロット内のすべての誤差バーは、平均の標準誤差 (SEM) を表します。

マウスをペントバルビタール (PTB) (100 mg/kg、腹腔内) で深く麻酔し、(mM) NaCl 136.0、KCl 5.4、HEPES 10.0、グルコースを含む冷(4 ～ 8 °C) 分離バッファーを経心的に灌流しました。 5.5、重量オスモル濃度 290 ± 3 mOsmol/kg。我々は運動野と一次体性感覚野を分離し、マウスとラットの成人脳解離プロトコル（Milteyni-Biotec、ドイツ）に従いましたが、赤血球除去ステップは省略しました。最初期遺伝子（IEG）の活性化を防ぐために、酵素解離中に 30 μM、次のステップで 3 μM の転写阻害剤アクチノマイシン D（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）を使用しました24。破片を除去した後、細胞を5 mlのオボムコイド阻害剤溶液(ワーシントン、ニュージャージー州)の上に層にし、遠心分離(300×gで6分間)によって回収した。潜在的な細胞凝集体を70μmセルストレーナー(Becton Dickinson, NJ)によって除去した。最終懸濁液を、それぞれアロフィコシアニンおよびフィコエリトリンと結合した ACSA-2、Cd11b、および O4 抗体で標識し (4 °C、10 分; Miltenyi-Biotec、ドイツ)、アストロサイト 25、ミクログリア、希突起膠細胞の濃縮を可能にしました。フローサイトメトリー（FACS; BD Influx）を使用して細胞を濃縮し、ACSA-2 + 、Cd11b + およびO4 + 細胞を選別するように校正しました。 Hoechst 33258 (ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して生存率を確認しました。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＷａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を補充した２００μｌのＡｄｖａｎｃｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ培地中に収集した。細胞懸濁液の調製のために、条件ごとに 4 匹の動物をプールしました。 FACS 後、細胞懸濁液を遠心分離し、濃縮し、ライブラリーの調製に使用しました。

Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 (10 × Genomics, Pleasanton, CA) を使用してシーケンスライブラリーを調製し、プロトコールは製造元の指示に従って実行されました。簡単に説明すると、10 × クロムプラットフォームを使用して、細胞固有の 10 × バーコード、固有分子識別子 (UMI)、およびポリ (dT) 配列で覆われたビーズとともに、個々の細胞を液滴にカプセル化しました。逆転写後、cDNA ライブラリーが増幅され (13 ～ 14 サイクル)、断片化され、シーケンスアダプターにライゲーションされました。 SPRISelect 磁気ビーズを cDNA 懸濁液の精製と断片のサイズ選択に使用しました。ライブラリーの濃度と品質は、Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen) および Fragment Analyzer HS NGS Fragment Kit (#DNF-474、Agilent) を使用して測定しました。ライブラリーをプールし、Illumina NovaSeq 6000 SP 試薬キット、バーコードと UMI を含む Read 1、および目的の配列をカバーする Read 2 を使用してペアエンドモードで配列決定しました。シーケンスデータは約サンプルあたり 1 億～2 億リード (補足表 4)。

配列決定データは参照マウスゲノム GRCm38 とアライメントされ、STARsolo (STAR バージョン 2.7.3a) によって注釈が付けられました (GENCODE バージョン M8 アノテーション) 26。 100 UMI および FDR < = 0.001 のしきい値を持つ EmptyDrops 関数 (DropletUtils R パッケージ)27 を適用して、細胞を含む液滴のみを保存しました。各液滴/細胞に固有のバーコードに基づいて細胞をカウントしました。最終的に検出された細胞の数はサンプルごとに異なり、約 1 個の範囲でした。 2500 ～ 6800 セル (補足表 4)。

データは、Seurat R パッケージ (バージョン 4.1.1) を使用してさらに処理されました28。まず、すべてのサンプルからのデータを SCTransformed し、統合しました (それぞれ mt- または Rps/Rpl が接頭辞として付いているミトコンドリア遺伝子とリボソーム遺伝子を除く)。均一多様体近似および射影 (UMAP) を使用して 17 個の主成分 (PC) を視覚化し、その後クラスター化しました (FindNeighbors および FindClusters 関数、UMAP 解像度 0.5)。クラスターには、予想される細胞集団の既知のマーカー遺伝子の発現と、FindAllMarkers 機能で見つかったマーカーへの対応に基づいて注釈が付けられました (クラスター内の少なくとも 80% の細胞がマーカーを発現)。 DoubletFinder29 R パッケージは、複数の細胞を含む可能性のある液滴の識別に使用されました。ダブレット形成率は、10 × Genomics による推定値の 3.9 % に設定され、データは著者の推奨に従って処理されました。あいまいなマーカーを発現し、より多くのダブレットを含むクラスターは、データセットから除外されました。

性別 (男性、女性) は、X (Xist) および Y 染色体によってコードされる遺伝子の発現と、基準に一致しない細胞に基づいて個々の細胞に割り当てられました (男性: Xist の数 < 1、nFeature_Y > 0、女性: Xist の数、nFeature_Y > 0)。 Xist > 0、nFeature_Y < 2、nCount_Y < 2; nFeature_Y は Y にコードされた遺伝子の数、nCount_Y は Y 染色体にマッピングされる転写物の数です）はデータセットから除外されました（補足図1a）。「未定義」として分類されたこれらのセルは、セル総数のほぼ 1/3 を占め、低品質のセルを表していました (補足図 1b)。

特定の遺伝子発現プロファイルを使用して各細胞の細胞周期のフェーズ (CellCycleScoring Seurat 関数) を決定し、すべてのフェーズの細胞がクラスター間で均等に分布していることを確認しました。個々の細胞タイプは、検出された遺伝子の数 (nFeature_RNA)、カウント数 (nCount_RNA)、およびミトコンドリア RNA の量 (percent.mt) に基づいてフィルタリングされました。対象となる各細胞タイプに固有のカットオフは次のとおりです: アストロサイト - nFeature_RNA > 1000、2000 < nCount_RNA < 10,000、percent.mt < 8。ミクログリア - nFeature_RNA > 700、1000 < nCount_RNA < 10,000、percent.mt < 5; 希突起膠細胞 - nFeature_RNA > 1300、2500 < nCount_RNA < 50,000、percent.mt < 5 (補足図 1d)。組織の解離は、刺激に対する最初の迅速な細胞応答である IEG の発現を誘導する可能性があります 24,30。 IEGのセット（例：FosおよびJun転写因子）をAddModuleScore機能を使用してUMAPに投影し、サンプル調製によるこれらの遺伝子の誘導レベルを調査しました（補足図1c）。 SoupX R パッケージ (バージョン 1.5.2)31 を適用して、汚染された RNA バックグラウンドを除去しました。フィルタリングされていない注釈付きデータが入力として提供されました。汚染率は自動化された方法で推定され、個々のサンプルで 1 ～ 2 % の範囲でした。その後、カウント値は汚染について補正されました。

擬似バルク主成分分析 (PCA) によってサンプル間の全体的な差異を表示するために、正規化およびスケーリングされたデータセットを使用して、同じ条件、年齢、性別に属する細胞の遺伝子数を合計することにより擬似バルクデータを作成しました。

単一細胞データセット内の示差的に発現された遺伝子 (DEG) は、Seurat の FindMarkers 関数の t 検定によって特定されました。この分析では、RNA アッセイの正規化およびスケーリングされたデータが使用されました。 P 調整値 (padj) 閾値を 0.05 に設定し、log2 倍率変化 (log2FC) > 1 または < - 1 を持つ遺伝子は差次的に発現するとみなされました。細胞の種類と状態ごとに、各時点で男性と女性を比較しました。対照（ＣＴＲＬ）およびＳＯＤ１のペアも、各時点および各細胞型について試験した（補足表１の末期ＤＥＧ）。 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)32 は、clusterProfiler R パッケージ (バージョン 4.0.5)33,34 を使用して実行されました。参照遺伝子セットのサイズは 10 ～ 800 遺伝子に制限され、有意性閾値は Padj = 0.05 に設定されました。複数の遺伝子が濃縮に寄与した結果 (コア濃縮) のみが関連しているとみなされました。

対象となる個々の細胞タイプ (星状膠細胞、ミクログリア、希突起膠細胞) を個別に分析しました。ミトコンドリア遺伝子とリボソーム遺伝子はその後の分析には含まれていませんでした。次に、フィルタリング、正規化、スケーリングおよび SCTransformed データに対して PCA が適用されました。品質管理の範囲内で、クラスター化にさらなる望ましくない変動を導入するため、いくつかの遺伝子が除外されました (Sod1、Gm8566、Cmss1、Cdk8、および lncRNA Xist、Gm42418、Gm424181、Malat1)。ミクログリアおよびアストロサイトについては 16 PC、希突起膠細胞については 17 PC を UMAP を使用して視覚化し、解像度 0.2 (FindNeighbors および FindClusters 関数) でクラスター化しました。 3 M 時点の雄対照細胞のクラスターは、サンプル調製中に誘導された可能性のあるストレス関連マーカー遺伝子 (Cdkn1a、Fkbp5 など) を発現しているため、星状細胞および稀突起膠細胞のサブセットから除外されました (補足図)。 2)。

サブクラスターのマーカーは、FindAllMarkers 関数のデフォルトの Wilcoxon テストを使用して特定されました (クラスター内の少なくとも 10 % の細胞が特定のマーカーを発現、log2FC > 0.25、補足表 3)。サブクラスターの同一性は、AddModuleScore 関数を使用した、以前に記載されたさまざまな細胞サブタイプの利用可能な遺伝子シグネチャとの比較、および計算されたマーカー遺伝子に基づく手動のアノテーションによって決定されました。参照遺伝子発現シグネチャは、Habib ら 5 (Gfap-Low および Gfap-High アストロサイト)、Sala Frigerio ら 4 (ARM、IRM)、および Marques ら 35 (MFOL1/2、MOL2、MOL5/6) から取得されました。）。星状細胞の中間状態は、クラスター 2 の計算されたマーカーと Habib らによって発表された遷移状態のマーカーを含む遺伝子セットを使用して視覚化されました5。恒常性ミクログリアの特徴は、Keren-Shou ら 3、Mathys ら 36、Butovsky と Weiner 37 で言及されている恒常性マーカーの組み合わせから生じました。上位 30 個の遺伝子はアストロサイトの投影に使用され、20 個の遺伝子はミクログリアと希突起膠細胞で使用されました。発現差解析 (DEA) および部分集団解析に入る細胞の数は、補足に記載されています。タブ。 4.

まず、この研究で使用した動物モデルに特徴的な、予想される疾患に関連した表現型の変化を調査しました。私たちの目標は、病気の主な転換点を評価し、その進行を特徴づけることでした。

表現型を研究するために、ワイヤーグリッドハングテストとロータロッドパフォーマンステストという 2 種類の行動テストを使用しました。我々は、SOD1(G93A) 変異を有する動物 (SOD1) と対照動物 (CTRL) の比較可能なグループを、各グループ内の雄と雌の数が偶数であるようにテストしました。試験期間 (1 か月) の開始時に、すべての動物は両方の試験で最長時間 (180 秒) を実行しました (「方法」セクションを参照)。 CTRL 動物と SOD1 動物の違いは、主に筋力がテストされるワイヤーグリッド吊り下げテストで最初に顕著でした (図 1a)。違いは生後 2 か月で顕著になったため、この時点が始まりであると考えました。その後、パフォーマンスは徐々に低下し、3 か月後に突然低下し、症状段階の始まりを示しました。この段階はさらなる能力の低下を伴い約1か月続き、その後動物は重度の運動機能障害を特徴とする最終段階に達した。ロータロッドによって測定された動物の運動調整の低下（図1c）は、最終段階でのみ顕著でした。

行動検査および免疫組織化学による皮質病理評価。 (a) 吊り下げワイヤーテストにより、CTRL と比較して進行中の SOD1 動物の運動能力の低下が確認されました。 (b) 性別に基づいて分割された SOD1 動物を比較した吊り下げワイヤーテストの結果から、発症における表現型の違いが明らかになりました。 (c)、(d) CTRL 動物と SOD1 動物を比較したロータロッドの結果では、進行における有意な変化は示されませんでした。統計的有意性は、Holm-Sidak の事後検定を備えた二元配置分散分析を使用して決定され、誤差バーは SEM を表します。 *padj ≤ 0.05、**padj ≤ 0.01、***padj ≤ 0.001。 n は実行動物の数を示します。

SOD1の男性と女性のパフォーマンスを調査したところ、ワイヤーグリッド吊り下げテストにより、一般的に症状の発症と進行に違いがあることが明らかになりました（図1b）。男性の発症は早く、全体的に女性よりも悪かったが、これは人間の病理学と一致している 38。しかし、発症が遅いにもかかわらず、症候期の女性のパフォーマンスは男性よりも早く低下し、最終段階では男女ともに同様の結果となった。ロータロッドの測定では、進行中の運動調整における有意な性差は明らかになりませんでした。

したがって、行動試験によりモデルの特徴が確認され、性差が特定され、病気の 4 つの主要な時点が決定されました。これらの時点は次の実験で考慮されました。

scRNA-seq実験は次のように設計されました（図2a）：CTRLおよびSOD1マウスは、疾患の主要段階を表す4つの時点で屠殺され、各時点で条件ごとに2匹の雄と2匹の雌が使用されました。すべての細胞懸濁液は運動皮質組織および体性感覚皮質組織から調製され、FACS を使用して 3 種類のグリア細胞 (アストロサイト、ミクログリア、稀突起膠細胞) が濃縮されました。

単一細胞 RNA シーケンス実験の概要。 (a) シーケンス実験のプロセスを要約したスキーム。 (BioRender.com で作成) (b) すべてのサンプルからの細胞を含む、特定された細胞クラスターの UMAP プロット視覚化。 ASTRO n = 5536、MG n = 8429、OLIGO n = 6180、PVM n = 434、OPC n = 165、COP n = 98、PERI n = 395、ENDO n = 235、ENDO/PERI n = 108、合計 n = 21,580。 (c) クラスター表現と、条件と性別の両方における標的グリアの有病率の視覚化。 CTRL n = 7646、SOD1 n = 12,499、女性 n = 10,246、男性 n = 9899。(d) 細胞クラスターの識別に使用される標準マーカー遺伝子のリスト。 ASTRO - アストロサイト、MG - ミクログリア、PVM - 血管周囲マクロファージ、OPC - 希突起膠細胞前駆細胞、COP - コミット型希突起膠細胞前駆細胞、OLIGO - 希突起膠細胞、PERI - 周皮細胞、ENDO - 内皮細胞。

scRNA-seqデータは、初期品質管理、フィルタリング、およびクラスタリングに従い、結果として得られた単一細胞のセットには、個々のグリア細胞集団の標準マーカー遺伝子の発現を使用して注釈が付けられました（図2b、d）。予想通り、データセット内で最も多数のクラスターはアストロサイト (Aqp4、Aldh1l1、Gjb6)、ミクログリア (Cx3cr1、Aif1)、希突起膠細胞 (Mobp、Apod) として特定されました。稀突起膠細胞前駆細胞 (OPC) および分化型希突起膠細胞前駆細胞 (COP) は、データセット内に多く存在する成熟希突起膠細胞とは別にクラスター化されました。これらの集団のマーカー遺伝子は部分的に重複しており、OPC が希突起膠細胞 (Emid1、Pdgfra、Sox6、Vcan、Plp1、Cldn11 など) に徐々に成熟していることを示しています。さらに、血管周囲のマクロファージ、周皮細胞、および内皮細胞は少数でした。

各細胞には、X および Y 染色体関連遺伝子の発現に基づいて性同一性が割り当てられました。性決定の基準を満たさなかった細胞（方法、補足図 1a、b を参照）は、さらなる分析から除外されました。 CTRLまたはSOD1、または男性または女性のサンプルで特異的に過剰発現する細胞クラスターはなく、細胞調製の堅牢性が確認されました（図2c）。さらに、ミトコンドリア読み取りの割合が低く、前初期遺伝子の活性化が最小限であることにより、データの品質がさらに検証されました（補足図1c、d）。全体として、データセット内の標的細胞集団を特定することに成功し、条件と性別の両方でそれらの割合が等しいことを観察しました。

SOD1 マウスにおける遺伝子発現の変化に関する一般的な見解を提供するために、主要な細胞タイプのそれぞれを疑似バルクとして PCA に供しました (図 3a)。分析により、病気の進行中に男女ともCTRLサンプルとSOD1サンプルの間にわずかな変化が見られることが明らかになりました。サンプル間の最初の明らかな変化は、ミクログリアと希突起膠細胞で生後4か月で現れ、ALS様の病理に対するそれらの反応を示唆しました。 SOD1 星状細胞は、SOD1(G93A) および ALS14、18、19、39 の他のモデルで活性化されていることが頻繁に報告されていますが、変化せず、CTRL サンプルでクラスター化されました。特に、クラスタリングでは、生後 3 か月 (3 M) の雄のデータポイントの変位が示されました。これは星状膠細胞で最も顕著であり、ばらつきの最大の原因となっていました（PCA1 での分離に反映されています）。変動の原因を探索することにより、星状膠細胞および乏突起膠細胞内の細胞の小さなクラスターを特定しました。これは、300 匹の CTRL 雄にのみ存在しました (補足図 2)。このクラスターは、ストレス関連遺伝子 Cdkn1a および Fkbp5 の発現によって特徴付けられ、擬似バルク解析でそれぞれの主成分 (PC) で最も極端な負荷値を示し、3 M CTRL オスの変位に対するクラスターの効果が確認されました。データポイント。クラスターの存在はさらなる分析にほとんど影響を与えなかったため、クラスターをサンプル処理の技術的アーチファクトとみなしてデータセットから削除しました。しかし、この発見は、従来の一括分析では解釈が困難な細胞部分集団の小さな変化さえも特徴付ける単一細胞分析の力を示しました。

シュードバルクおよび差次的発現解析では、遺伝子発現のわずかな変化のみが明らかになります。 (a) 4 M でのミクログリアと希突起膠細胞の進行中の病状に対する共通の反応を示す、男性と女性のサンプルの疑似バルク PCA クラスター比較。(b) すべての細胞型の男性と女性で調節不全が見られた、差次的に発現されたいくつかの遺伝子の視覚化。 4M時点。 Xist は女性細胞を明確に区別しますが、Eif2s3y と Uty は両方とも男性染色体 Y によって発現されます。 (c) CTRL サンプルと SOD1 4 M サンプルを比較した DEA の結果は、最終段階で限られた数の上方制御および下方制御される遺伝子を示しています。 (d) 4 M での GSEA の結果を視覚化した濃縮曲線。希突起膠細胞で下方制御された遺伝子の中で 1 つの参照遺伝子セットが濃縮されました。 GO 用語の分析により、希突起膠細胞およびミクログリアで上方制御される遺伝子の中でミトコンドリア成分が豊富であることが示されました。

行動検査における性別関連の違い（図1a〜d）に基づいて、DEAによって性別間の潜在的なALS関連遺伝子発現の変動を調べ、CTRLとSOD1について男性細胞と女性細胞を別々に比較しました。解析では、設定されたしきい値 |log2FC|> 1 および Padj < 0.05 に基づいて、わずか数°の DEG しか得られませんでした。 X 染色体遺伝子 Xist は、遺伝子型に関係なく、3 つの細胞型すべてにおいて女性で有意に上方制御されていました。 Xist 遺伝子は、X 染色体の 1 つをサイレンシングすることで女性の遺伝子量補償に主要な役割を果たしており、したがって女性の細胞でのみ発現されます 40。 Y染色体によってコードされる2つの遺伝子（Eif2s3y、Uty）は男性で上方制御されましたが、それらの発現の差は星状細胞でlog2FC閾値を超えただけでした（図3b）。これらを除けば、病状の進行と性別に関連する他の調節不全遺伝子は私たちのデータでは見つかりませんでした。

疾患に関連した転写変化を調査するために、男性と女性を一緒に考慮して、各時点および各細胞型の CTRL サンプルと SOD1 サンプルの比較に対して DEA を実行しました。 Sod1遺伝子は、図3cおよび補足に示すように、末期段階を含む疾患の測定されたすべての段階においてDEGが有意に上方制御された唯一のものであった。タブ。 1 (|log2FC|> 1、padj < 0.05)、SOD1(G93A) モデルの妥当性が確認されました。他の調節不全遺伝子は、ほとんどが品質管理を回避した非コード転写物またはリボソーム転写物でした。さらに、4 M CTRL サンプルでは、すべての細胞型にわたって遺伝子 Cdk8 および Cmss1 の発現が増加していることが特徴でした。これら 2 つの遺伝子は、その後の分析で、サブクラスター化の結果に悪影響を与える交絡因子として同定されました (補足図 2a、b)。したがって、それらは ALS 様の病理とは関係のないバイアス要因と考えられました。まとめると、これらの結果は、性別に関係なく、SOD1(G93A) マウスの皮質における病状の進行に関連する遺伝子発現の変動が最小限であり、病気の後期におけるミクログリアと希突起膠細胞の微妙な変化を示していることを示しています。

DEA によって検出された遺伝子発現の最小限の変化の潜在的な生物学的重要性を調査するために、最も影響を受ける 4 M 時点に焦点を当てた GSEA32 を利用しました。 GSEA は、log2FC または p 値のカットオフに関係なく、すべての遺伝子の発現を考慮するため、個々の遺伝子の変化がわずかであっても、調節不全のプロセスを見つけることができます。

まず、我々はメタ分析アプローチを採用し、過去 20 年間に発表された 15 件のトランスクリプトーム研究から SOD1 変異の影響を受けたグリア細胞の遺伝子サインを収集しました (補足表 2)。このセットには、主に SOD1(G93A) モデルの脊髄に由来するデータが含まれています。 GSEA を使用して、生後 100 日のマウスの脳幹希突起膠細胞で下方制御されているとして Liu ら 15 によって最近報告された単一の遺伝子セットのみの濃縮を検出しました。一致して、我々の結果は希突起膠細胞の負の濃縮を示し（NES = − 1.32、padj = 6.3 × 10− 3; NES - 正規化された濃縮スコア、図3d）、皮質の4 M SOD1希突起膠細胞における小さいながらも重要な変化を示しています。ミクログリアまたはアストロサイトが豊富な遺伝子セットは見つかりませんでした。

メタ分析に加えて、データに豊富に含まれる遺伝子オントロジー (GO) 用語 41,42 も探しました。ミトコンドリアに関連する 2 つの活性化された用語が、我々のデータセットで上方制御されていることが判明しました。希突起膠細胞のミトコンドリアエンベロープ (NES = 1.11、padj = 8.2 × 10-3) とミクログリアのミトコンドリアタンパク質含有複合体 (NES = 1.73、padj = 1.1 ×) 10–6) (図 3d)。私たちのデータを裏付けるように、ミトコンドリアの機能不全は、変異型 Sod1 遺伝子だけでなく、他の ALS 関連の遺伝的摂動との関連でも、ALS 病理に寄与する要因の 1 つとして広く議論されています (Jankovic et al.43 で総説)。。

総合すると、DEG の数が少ないにもかかわらず、皮質希突起膠細胞とミクログリアのミトコンドリア機能の微妙な変化が特定されました。ただし、強化された用語の数とその重要性を考慮すると、機能不全の重症度はかなり低いです。

疑似バルク解析では、SOD1(G93A) 皮質グリアの遺伝子発現におけるわずかな変動のみが明らかになったので、我々は、病理学的変化は集団レベルで隠れたごく一部の細胞によって表される可能性があると推測しました。したがって、疾患の進行に関与している可能性のある部分集団を特定することを目的として、詳細なサブクラスター分析を実施しました。

星状細胞から始めて、CTRLサンプルとSOD1サンプルの両方に同様の割合で存在する3つのクラスターを特定しました（図4a）。これらのクラスターに注釈を付けるために、それらのマーカー遺伝子 (補足表 3) を計算し、アルツハイマー病 (AD) のマウスモデルにおいて Habib ら 5 によって記載された星状細胞サブタイプの遺伝子サインを視覚化しました。この研究では、反応性マーカーである Gfap-High と DAA を発現するアストロサイトの 2 つの類似した部分集団が特定されました。 Gfap-high は対照と AD サンプルに存在していましたが、DAA は AD モデルに特有であり、著者らは疾患の進行におけるそれらの潜在的な役割を示唆しました。私たちのデータのクラスター 3 のマーカー遺伝子は、Gfap-High クラスターのマーカー (遺伝子 Mt1、Mt2、Id3、Cd9、Vim など) と部分的に重複していましたが、SOD1 サンプルでは特に DAA は検出されませんでした。注目すべきことに、GfapおよびVimの発現レベルは低く、変異体SOD1(G93A)マウスの皮質におけるアストロサイトの病理学的反応が限定的であることを示唆している。この所見は疑似バルク解析の結果と一致しており、星状細胞に変化がないことが示されています。クラスター 1 は Gfap-low 星状細胞 (Luzp2、Trpm3 など) と共通の遺伝子を共有し、残りのクラスター 2 は Gfap-High クラスターと Gfap-Low クラスターの両方のマーカーを発現したため、中間状態のクラスターを表します。

部分集団分析により、SOD1 サンプル中の希突起膠細胞の独特な部分集団が明らかになりました。星状膠細胞 (n = 5292) (a)、ミクログリア (n = 8414) (b)、希突起膠細胞 (n = 5876) (c) CTRL および SOD1 条件に分割した部分集団の UMAP 視覚化 (左) (4 つすべての細胞を含む)タイムポイント。前述の部分集団の遺伝子発現サインが UMAP 上に投影されて示されています (中央上部)。アノテーションに使用される代表的なクラスターマーカーのリスト (中下)。 4 つの時点すべての細胞を含む、CTRL および SOD1 の部分集団の割合 (右)。（ d ）年齢に従って分割されたCTRLおよびSOD1希突起膠細胞のUMAP視覚化（1 M： n = 682、2 M： n = 1697、3 M： n = 1430、4 M： n = 2067）。棒プロットは、各時点での部分母集団の割合を示します。

図4bのUMAPプロットに示すように、ミクログリアは4つのクラスターにグループ化されました。クラスター 1 は、恒常性マーカーの発現によって特徴付けられました 3、36、37。クラスター 2 および 3 のミクログリアの遺伝子サインは、AD モデルで報告されている ARM の発現プロファイルに似ていましたが、健康な脳ではより少ない割合で同様でした 3,4。これらの活性化されたミクログリアは、Cx3cr1、P2ry12、Sall1などの恒常性遺伝子を特徴的に下方制御しており、これは我々のデータでも顕著です（図4b）。さらに、クラスター 3 は、ミクログリアの神経変性表現型の主要な制御因子である Apoe の発現が高いことによって特徴づけられました 44。クラスター 4 は IRM4 を表し、インターフェロン応答経路に関与する遺伝子である Ifit2、Ifit3、および Ifitm3 の発現によって明確に区別できました。ただし、IRM の割合はどちらの条件でも非常に低かったです。それにもかかわらず、本発明者らは、SOD1 サンプル (クラスター 2) で活性化されたミクログリアの亜集団のわずかな増加を検出し、病理学的刺激に応答してミクログリアの活性化が始まっていることを示唆しました。

希突起膠細胞は 4 つのクラスターを形成しました (図 4c)。クラスター 1 は、Mal、Plp1、Mog、および Opalin 遺伝子の発現を含む、Marques ら 35 によって記載されたミエリン形成希突起膠細胞 (MFOL) と同様の遺伝子発現サインを共有しました。これらの細胞は主に 1 か月 (1 M) の時点で存在していました (図 4d)。これは、生後数週間の齧歯動物における広範な髄鞘形成と一致しています 45。クラスター 2 は、Klk6 を発現する成熟希突起膠細胞 (MOL2) を表しますが、成熟希突起膠細胞マーカー Apod および髄鞘形成細胞に典型的な遺伝子 Pmp22、S100b、および Apc7、35、46 も示します。 Floriddia et al.7 は、MOL2 集団が脊髄の白質に多く存在するが、皮質にはそれほど多くないことを報告しました 35。両方の条件における割合は、クラスター 1 と 2 で同様でした。クラスター 3 と 4 に関しては、成熟希突起膠細胞集団 MOL5/67,35 に見られるいくつかの遺伝子の発現の増加が示されました。興味深いことに、クラスター 4 は SOD1 サンプルにほぼ独占的に存在し (図 4d)、Apoe および Il33 の発現が高いことを特徴としていました。 Il33 は、病変内の希突起膠細胞および星状膠細胞で上方制御されており、ストレスまたは損傷を受けた細胞によって放出される可能性があります。これは抗炎症作用があり、ミクログリアの活性化を促進します (Sun et al.47 で総説)。 Ill33 の上方制御は、AD のマウスモデルにおける疾患に関連する希突起膠細胞で以前に報告されています48,49。 Apoe は免疫稀突起膠細胞 (ImOLG) のマーカー遺伝子として同定され 50、多発性硬化症病変に多く存在し、慢性脱髄および再髄鞘化への継続的な試みにおける Apoe の役割が示唆されています 51。したがって、クラスター 4 は、4 M SOD1 皮質の病理学的刺激に応答する希突起膠細胞の損傷または反応状態を表すと仮説を立てます。 SOD1で観察された活性化ミクログリアの数のわずかな増加と、おそらくアストロサイトの中間状態への移行（それぞれ図4a、b）が、損傷/活性化希突起膠細胞に対する反応であるかどうかを推測したくなります。グリア細胞の疾患に関連した状態間のこの種の相互作用は、最近 AD52 と ALS2 で報告されました。

全体として、アストロサイト、ミクログリア、稀突起膠細胞の複数の亜集団を同定することができ、以前に記載された特定の細胞サブタイプの遺伝子発現パターンを認識しました。しかし、私たちの予想に反して、損傷/活性化された希突起膠細胞を除いて、SOD1 サンプルでは疾患に関連する部分集団は検出されませんでした。

scRNA-seq 解析の結果は、SOD1(G93A) マウスモデルの皮質グリアに小さな変化があることを示唆しました。この結論をさらに調査し検証するために、表現型の変化が最も顕著である4Mの時点で、運動皮質および一次体性感覚皮質（配列決定に使用される同一の領域）のグリアの免疫組織化学的分析を実施しました。関心領域内の画像化されたゾーンを図 5a に示します。形態学的変化は脊髄でよく説明されているため、最終段階 (4 M) で脊髄の腰部も染色し、それらの写真を動物の進行性グリオーシスの参考として使用しました。

免疫組織化学 (a) 上の図は、形態学的変化の調査と APC および CC3 の定量化のためにスキャンされた 12 の領域を示しています。下の漫画は、MBP 分析のためにスキャンされた 24 の領域を示しています。 (b) 蛍光分析では、SOD1 (n = 6) 動物と CTRL (n = 6) 動物の皮質星状細胞の間の形態における有意な違いは明らかになりませんでした。（ c ）アストロサイトを比較した皮質と脊髄のALDH1L1染色の代表的な写真は、脊髄ではSOD1とCTRLの間の形態学的違いを示していますが、皮質では顕著な違いはありません。 (d) Sholl 分析の結果は、CTRL (n = 6) サンプルと SOD1 (n = 6) サンプルの両方で非常に類似したミクログリアの複雑性を示しました。赤い同心円状の半径を持つショールマスクは、分析に使用された単一のしきい値のあるミクログリアを示しています。（ e ）IBA1で染色した皮質および脊椎スライスの代表的な画像は、脊髄ミクログリアの明らかなアメーバ形態を示していますが、皮質の球状末端（クローズアップを参照）によって表される微妙な形態変化のみを示しています。 (f) 皮質における MBP の定量化により、SOD1 (n = 6) と CTRL (n = 6) の間に有意差がないことが明らかになりました。 APC + 細胞の数は SOD1 (n = 3) と CTRL (n = 3) の間で一致し、希突起膠細胞のアポトーシスのマーカーとして使用される CC3 で共染色された APC + 細胞の数も同様のままであり、明らかな希突起膠細胞がないことを示唆しています。変性。 (g) MBP、APC、および CC3 染色の代表的な画像。スケールバー、20 μm。統計的有意性は、対応のない t 検定を使用して決定されました。エラーバーは SEM を表します。 nは使用した動物の数を示します。

ALDH1L1 マーカーを使用して星状細胞を染色し、突起を含む細胞全体の形態を検査することができました。アストログリオーシスは、細胞体の拡大と突起の短縮と肥厚を特徴とする形態学的変化であり、病理学的状態にあるアストロサイトの特徴的な反応であり、ALS 脊髄でよく説明されています 13,14。皮質では、形態学的差異を見つけるために蛍光分析を実施しました（図5b）が、分析ではSOD1アストロサイトとCTRLアストロサイトの両方の蛍光値が非常に類似していることが示され、活性化に関連する細胞の拡大がないことが示唆されました。同様の形態は、脊髄腰部の前角の星状膠細胞と比較して図5cに見られ、明らかに短縮された突起を伴う拡大した本体を示しました。蛍光分析の結果は、遺伝子発現レベルでアストロサイトにほとんど変化が検出されないか、まったく変化が検出されないことと一致しています。

ミクログリアは、アストロサイトと同様、病理学的刺激に応答してその形態を変化させます。それらはプロセスを収縮させ、活性化状態に典型的な特定のアメーバ形状を採用します。ミクログリアを視覚化するために、IBA1 抗体を使用し、比較のために皮質と腰髄の両方を染色しました。形態の変化を評価するために使用したSholl分析（図5d）は、細胞の樹木形成の複雑さを定量化するために頻繁に行われます。分析により、SOD1 皮質ミクログリアの形態が CTRL 動物と大きく変わらないことが確認されました。活性化された表現型を示唆する、より短いプロセスや分岐の減少は検出されませんでした。しかし、分析中に、プロセスのいくつかの先端が球根状で拡大しているように見えることに気づきました（図5e）。球状末端と呼ばれるこれらの構造は、損傷後のミクログリアの最初の反応として現れ 53 、トランスクリプトームデータで観察されるミクログリア活性化の初期段階を表す可能性があります。一方、脊髄の前角にある SOD1 ミクログリアは、活性化に関連する非常に短く肥厚した突起を持つ典型的なアメーバ状の形状を示します。

以前の分析では、細胞の特定の部分がアポトーシスを起こしていることを示唆する SOD1 特異的希突起膠細胞クラスター (クラスター 4) が同定されました。したがって、我々は慢性脱髄、壊死、またはアポトーシスに関連するタンパク質発現の変化に焦点を当てました。したがって、ミエリン形成のマーカーであるミエリン塩基性タンパク質 (MBP)、成体希突起膠細胞のマーカーである大腸腺腫性ポリポーシス (APC)、およびアポトーシスマーカーである切断型カスパーゼ 3 (CC3) を染色しました。 SOD1動物の皮質におけるMBPシグナル強度およびAPC + 希突起膠細胞の数の定量化により、CTRLと比較してMBPまたはAPC + 細胞の有意な減少がなかったため、脱髄プロセスが除外されました（図5f）。同様に、CC3とAPCの同時染色では、SOD1またはCTRLのいずれでもCC3 + オリゴデンドロサイトの存在量の違いは明らかにならず、同様のアポトーシス率を示唆しています（図5f）。 MBP染色とAPCおよびCC3陽性の細胞の代表的な画像を図5gに示します。まとめると、データは希突起膠細胞の重大な脱髄または変性を示さなかったので、400 匹の動物の scRNA-seq で同定された SOD1 特異的クラスター 4 は、死にかけている細胞または損傷した細胞を表していない可能性があります。

総合すると、SOD1 マウスの皮質グリアに重大な形態学的変化は検出されませんでした。希突起膠細胞は細胞死の増加や MBP タンパク質の損失を示さず、ALS マウスの皮質でその機能が維持されていることを示唆しています。

ALS は進行が速く、効果的な治療戦略が存在しない重篤な神経変性疾患です。これは主に運動ニューロン疾患として認識されていますが、グリア細胞などの他の細胞型も疾患の進行に寄与しているため、将来の治療の潜在的な標的となります。これまで、この病気のメカニズムを理解するため、また治療標的の探索を容易にするために、複数の実験モデルが開発されてきました。その中で、SOD1(G93A)マウスモデルは、現在のALS研究で使用される最もよく特徴付けられたマウス系統として主要な位置を占めています。長期的な適用にもかかわらず、さまざまな CNS 領域にわたる病理学的変化の影響はまだ完全には理解されていません。

皮質に対する病理学的影響は、ALS によって深刻な影響を受ける随意運動の計画、制御、および実行における皮質の役割のため、特に興味深い。 ALS 患者の皮質の病理学的変化は、1869 年にこの疾患が初めて報告されて以来報告されており、皮質の構造異常のモニタリングが標準的な ALS 診断手順になりました 54。皮質 MN の死とともに、DAM 様遺伝子発現サイン 56、脱髄 8、希突起膠細胞の機能の有髄化から神経支持への変化 57 を伴う、ミクログリア症 11,55,56,57 などのグリアの変化も観察されています。

ヒトにおける変化は十分に記録されているが、ALS 様の病状が SOD1 モデルの皮質に及ぼす影響についてはあまり知られていない。 SOD1(G93A) モデルでは、皮質 MN 変性が Özdinler ら 17 らによって初期に観察され、グリアの変化も観察されました 18,19,20。 SOD1(G93A)皮質の反応性アストロサイトは、ニューロンに対する毒性効果を維持しながらも、脊髄の対応物とは異なることが示されました18、19、58。しかし、Gomes et al.19 も、ミクログリアや希突起膠細胞では重大な遺伝子発現の変化は報告されなかった。さらに、SOD1 モデルの病理は脊髄および球運動ニューロンのみに限定されており、運動皮質には影響を及ぼさないと示唆する研究者もいます 21。したがって、このような相反するデータは、SOD1 マウスモデルで皮質がどの程度影響を受けるのか、またこのモデルがヒトの皮質病理をどの程度再現するのかという疑問を引き起こします。

この知識のギャップを埋めるために、免疫組織化学に裏付けられた単一細胞 RNA シーケンスを適用して、遺伝子発現の変化、疾患関連細胞集団の存在、SOD1 における ALS 様の病理に伴う皮質グリアの形態学的またはその他の病理学的変化を検出しました。 G93A) マウスモデル。 ALS 様の表現型は、McCombe と Henderson によって報告されているように、疾患の進行における性依存的な違いを含む行動検査によって確認されました 38。グリアに焦点を当てた scRNA-seq の結果では、ミクログリアと乏突起膠細胞の小さな変化が明らかになり、アストロサイトでは ALS 関連の有意な変化は示されませんでした。これは、アストロサイトの反応性表現型を報告するいくつかの研究と矛盾します 18,19,58。 SOD1(G93A) モデルで唯一顕著に調節不全を起こした遺伝子は Sod1 でしたが、GSEA はミクログリアと希突起膠細胞におけるミトコンドリアの機能不全を示しました。最近、Liu ら 15 によって、生後 100 日の SOD1 マウスの脳幹から単離された希突起膠細胞でも同様の変化が観察されており、エネルギー経路の調節不全の可能性が示唆されています。

私たちのデータは、ALS の影響を受ける皮質脊髄路の終点領域を表す運動皮質および一次体性感覚皮質内で生成されたため、発生部位と ALS の進行方向に関する基本的な疑問に対処することができます。現在、2 つの仮説があり、どちらも一連の証拠によって裏付けられています (van den Bos et al.59 で概説)。「ダイイングフォワード」仮説は、ALS が皮質で発生し、脊髄 MN に向かって広がることを示唆しています。一方、「ダイイングバック」仮説は、ALS が筋肉または神経筋接合部内で始まることを提案しています。末期SOD1マウスの高度なALS様表現型と、他の場所で観察された脳幹と脊髄のより顕著な変化を考慮すると、我々のデータが示す皮質のより穏やかな変化は、「ダイイングバック」仮説をより支持する。 SOD1(G93A)マウスにおいて。興味深いことに、これは、SOD1(G86R)マウスにおけるALSの開始点が皮質であることを示すBurgらの報告60とは対照的である。矛盾したデータは、疾患の性質に対する特定の点突然変異の異なる影響を示唆している可能性があり、さらなる調査が必要です。

運動皮質に対する SOD1 変異の影響を調査したこれまでの報告の多くは、限られた数の遺伝子およびタンパク質の測定 19,20,55、または細胞集団のバルク解析 18,61 に依存していました。その結果、分析の感度が低下し、データの解釈可能性が制限されました。この研究では、ハイスループット scRNA-seq を使用し、バルクアプローチでは区別できない小細胞集団の詳細な分析を可能にしました。 scRNA-seq を使用した最近の独創的な研究により、疾患の進行に主要な役割を果たしているさまざまな疾患関連グリア集団が明らかになりました 3,4,5,6。興味深いことに、これらの集団の多くは複数の疾患に存在しており、病理学的刺激に応答してグリア細胞によって採用される共通の機構を示唆しています。例えば、DAM 様集団はアルツハイマー病だけでなく、SOD1(G93A) マウス 3 の脊髄や脊髄損傷モデル 62 でも確認されました。私たちの研究では、これらの集団を検索しましたが成功しませんでしたが、バルク転写レベルおよび免疫組織化学によって観察された最小限の変化が確認されました。我々は、ミクログリアと稀突起膠細胞を除いて、対照動物とSOD1(G93A)動物の間でほぼ同様の細胞組成を発見した。ミクログリアの場合、活性化されたミクログリアの割合がわずかに増加していることが観察され、ミクログリアの活性化の開始段階が示唆されました。データは、ミクログリア突起上の球状末端を明らかにする免疫組織化学によって完成されました。オリゴデンドロサイトではさらに明白な変化が観察され、サブクラスター分析により、Apoe および Il33 の発現増加を特徴とし、4 M SOD1 サンプルに特異的に濃縮されるユニークなオリゴデンドロサイト集団の存在が確認されました。免疫組織化学において希突起膠細胞の重大な損失がないこと、またはより高いアポトーシス率を考慮すると、疾患の進行におけるこの希突起膠細胞集団の積極的な役割について推測することができます。これは、多発性硬化症の進行6および老化白質63における希突起膠細胞の積極的な役割を示唆する最近の証拠とも一致しており、広く受け入れられている受動的な役割とは対照的である。注目すべきことに、上記のApoeまたはIl33を除いて、以前に報告された疾患に関連する希突起膠細胞6、48、49、50と同様の発現パターンは観察されませんでした。ただし、これは、データ全体で観察された遺伝子発現の全体的な穏やかな変化に関連している可能性があります。

結論として、我々の研究は、疾患の非常に末期であっても、SOD1(G93A)モデルでは皮質グリアがわずかに影響を受けるだけであることを実証した。さらに、scRNA-seq の力により、希突起膠細胞が潜在的に病理に積極的に関与していることを示し、さらなる研究でその役割に取り組む重要性を強調しました。最後に、我々の結果を反映して、SOD1(G93A) マウスモデルはヒトの疾患を完全には再現していないことを示唆し、皮質 ALS 病理の研究には別のモデル系を使用することを推奨します。

まとめると、我々の結果は、SOD1(G93A) マウスの感覚運動皮質に存在する ALS 様の病理学的変化が最小限であることを示唆しています。このモデルが皮質で発生する病理を含めて疾患を完全に模倣しているかどうかについては、この分野で議論が続いており、公表された結果には議論の余地がある。グリア細胞を複数のレベルで検査した私たちの集合的な結果では、SOD1アストロサイトの大きな変化は明らかにならず、最終段階のミクログリアと稀突起膠細胞のわずかな変化のみが明らかになりました。ミクログリアと希突起膠細胞の変化は、病理に関連した活性化の開始を示唆していますが、変化の程度はヒト組織で説明されている病理に対応しません。しかし、最終段階で同定されたSOD1特異的希突起膠細胞は、神経変性におけるその積極的な役割を報告する最近発表された証拠に寄与しており、希突起膠細胞がCNS疾患において単に受動的であるという長期にわたる定説を大きく否定している。しかし、活性化の兆候にもかかわらず、SOD1(G93A) マウスの皮質のグリア細胞に対する ALS 様病理の影響はわずかであり、我々のデータは、ALS の皮質病理を研究するためのこのモデルの使用に対する支持証拠を提供します。

この現在の研究中に生成された scRNA-seq データは、NCBI の Gene Expression Omnibus64 で入手でき、GEO シリーズのアクセッション番号 GSE206330 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc) を通じてアクセスできます。 =GSE206330)。

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著者らは、優れた技術支援をしていただいた Helena Pavlikova 氏と Marketa Hemerova 氏、そして原稿の校正をしていただいた Frances Zatrepalkova 氏に感謝いたします。この研究は、チェコ科学財団からの助成金 23-05327S および 19-02046S、カレル大学助成機関（助成金番号 158320）、機関支援 RVO 86652036、MEYS CR（CZ.1.05/1.1.00/）によって支援されました。 02.0109)、チェコ科学アカデミー (戦略 AV21、助成番号 VP29)、EJP RD COFUND-EJP N° 825575 に基づく欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラム、および EU – 次世代 EU、LX22NPO5107 (MEYS) による。顕微鏡検査は、MEYS CR (LM2023050 Czech-Bioimaging) の支援を受けた実験医学研究所 CAS の顕微鏡サービスセンターで行われました。

これらの著者、Tereza Filipi と Zuzana Benesova も同様に貢献しました。

細胞神経生理学部門、実験医学研究所、チェコ科学アカデミー、ヴィデンスカ 1083、14220、プラハ、チェコ共和国

テレザ・フィリピ、オンドレイ・ヴァナトコ、ヤナ・トゥレコワ、モニカ・クビスコワ、デニサ・キルダヨワ、ミロスラヴァ・アンデロワ

カレル大学第二医学部、V Uvalu 84、15006、プラハ、チェコ共和国

テレザ・フィリピ & オンドレイ・ヴァナトコ

遺伝子発現研究所、バイオテクノロジー CAS 研究所、BIOCEV、Prumyslova 595、25250、Vestec、チェコ共和国

ズザナ・マツソワ、パベル・アバフィ、シャールカ・ベネソワ、ルーカス・ヴァリフラッハ

カレル大学理学部、Albertov 6、12800、プラハ、チェコ共和国

ズザナ・マツソワ

化学技術大学、化学技術学部、情報学および化学学科、Technicka 5、16628、プラハ、チェコ共和国

シャールカ・ベネソワ

生体膜機能組織部門、実験医学研究所、チェコ科学アカデミー、ヴィデンスカ 1083、14220、プラハ、チェコ共和国

ヤクブ・ザフメンスキー

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TF と ZM はデータを解釈し、原稿を書き、すべての図を準備しました。 TF、ZM、PA、OV、JT、MK、DK が実験を行いました。 TF、ZM、PA、LV、JT、。 OV と SB が分析したデータ。 JZ は免疫組織化学分析用のマクロを作成しました。 MA と LV がこの研究を考案し、監督しました。著者全員が原稿をレビューし、編集しました。

Lukas Valihrach または Miroslava Anderova への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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受信日: 2022 年 10 月 25 日

受理日: 2023 年 4 月 15 日

公開日: 2023 年 4 月 21 日

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SOD1(G93A)マウスの皮質グリアはALSによって微妙に影響を受ける