血管平滑筋 RhoA は MAP4K4 活性を調節することで腹部大動脈瘤の形成を阻止する

Communications Biology volume 5、記事番号: 1071 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

小型 GTPase RhoA が腹部大動脈瘤 (AAA) の病理に役割を果たしているかどうかは不明です。ここで我々は、正常領域と比較して、ヒトAAA病変ではRhoA発現が減少していることを示す。さらに、血管平滑筋細胞 (VSMC) 特異的 RhoA コンディショナルノックアウト (cKO) マウスでは、AAA 形成の発生率が増加します。 RhoA cKO マウスの大動脈輪および VSMC の収縮性は低下し、RhoA の喪失により VSMC の収縮性に関連する遺伝子の発現が減弱します。 RhoA の枯渇は、大動脈および VSMC におけるマイトジェン活性化タンパク質 (MAP) キナーゼシグナル伝達 (MAP4K4 を含む) を活性化します。 DMX-5804 による MAP4K4 活性の阻害により、AAA 形成が減少します。活性型 RhoA への結合タンパク質である Set は、RhoA の非存在下で MAP4K4 の阻害剤である PP2A を隔離することにより、MAP4K4 の活性化剤として機能します。結論として、RhoA は Set と協力して MAP4K4 の阻害を通じて AAA 形成に対抗します。

腹部大動脈瘤（AAA）は大動脈破裂や突然死を引き起こすため、生命を脅かす血管疾患です1。 AAA は、血管平滑筋細胞 (VSMC) の力生成の変化、弾性線維の分解と断片化、内側 VSMC の損失、炎症などのいくつかの要因によって形成されます 2,3。 VSMC の収縮性の障害は、AAA の主な促進要因である可能性があります。 AAA 患者の VSMC は、非病的対照 VSMC と比較して、最大収縮が損なわれていることが最近示されました4。機械的ストレスに応答するために、VSMC はα-平滑筋アクチン (α-SMA または ACTA2) や平滑筋ミオシン重鎖 11 (MYH11) などの収縮タンパク質を高レベルで発現し、これらの細胞は大動脈壁の安定化に不可欠です。。さらに、収縮タンパク質とその関連分子は、細胞外マトリックス (ECM) との連携を通じて機械的特性を調節することにより、大動脈内での力の分布に貢献します5。対照的に、VSMC の力の発生が減少すると、マトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP) の活性と炎症性サイトカイン/ケモカインの分泌が増加します 6、7、8。 AAAの形成を防ぐには、VSMCを健全に保つことが重要であると考えられています。しかし、VSMC の収縮能力がどのように調節されているかは完全には明らかではありません。

RhoA は、VSMC で豊富に発現される GTPase です9、10。 RhoA の活性は、活性型 GTP 結合型と不活性型 GDP 結合型の間で循環することによって制御されます11。 RhoA を活性化するために、グアニンヌクレオチド交換因子は RhoA からの GDP の放出を誘導し、その結果サイトゾルから GTP が捕捉されます。活性化された RhoA は、下流のエフェクターにシグナルを伝達します 12。 RhoA を不活化するには、GTPase 活性化タンパク質 (GAP) が RhoA の固有の加水分解活性を強力に刺激し、GTP を GDP に加水分解します。 RhoA は、VSMC の調節において複数の機能を持ち、大動脈構造の形態学的サポートと維持に貢献しています 13。 RhoA の下流の分子である Rho 関連コイルドコイル含有キナーゼ (ROCK) は、アクチン動態、細胞収縮、細胞運動性など、RhoA の機能のほとんどを媒介します 14。 RhoA/ROCK の機能不全は、動脈硬化、虚血性損傷、肺高血圧、心不全の発症に関連しており、心血管疾患の発症につながります 15。 ROCK を介した血管系における RhoA の役割は精力的に研究されています。しかし、VSMC 内の RhoA 自体が大動脈の恒常性をどのように調節するのかは依然として不明である。

上記の背景を踏まえ、AAA 患者の正常領域と AAA 領域における RhoA 発現量を調べたところ、AAA 領域の内層で RhoA 発現量が顕著に低下していることが判明した。大動脈VSMCにおけるRhoAの機能をさらに調査するために、VSMC特異的RhoAコンディショナルノックアウト（cKO）マウスをCre/loxPシステムによって作製した。薬理学的刺激は、対照マウスと比較して、RhoA cKO マウスにおいて AAA 形成を高度に誘導した。 VSMCにおけるRhoAの喪失は、大動脈輪およびVSMCの収縮性および収縮性に関連する遺伝子の発現を著しく低下させ、炎症反応および内皮損傷を増加させ、タンパク質分解性および炎症性VSMC表現型をもたらした。我々は、VSMCにおけるRhoAによるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ4（MAP4K4）の阻害がAAA形成の予防に重要であることを実証した。我々のプロテオミクス分析は、RhoA が MAP4K4 を負に制御する根本的な分子機構を解明するのにさらに役立ちました。

ヒトAAAにおけるRhoA発現を調べる前に、ヘマトキシリン・エオシン（HE）およびエラスチン特異的バーホーフ・ヴァン・ギーソン染色によって、AAA患者の大動脈壁における破壊された内側層と無傷な内側弾性線維の損失を確認しました（図1a、b）。）。大動脈の免疫組織化学および免疫染色により、正常領域と比較してAAA領域の内層でRhoA発現が著しく減少していることが明らかになりました（図1c〜f）。これらの結果と一致して、大動脈壁サンプルの qPCR およびウェスタンブロッティングでは、AAA 領域における RhoA mRNA およびタンパク質の発現が大幅に減少していることが示されました（図 1g–i）。これらの観察は、ヒト AAA では RhoA 発現が低下していることを示しており、RhoA 発現の低下が AAA の発症に関与している可能性があることを示唆しています。さらに、大動脈壁の内皮層と内皮層の両方が破壊されたため、AAA 領域では VSMC と内皮細胞マーカータンパク質 α-SMA および CD31 の発現レベルがそれぞれ減少しましたが、線維芽細胞マーカータンパク質ビメンチンのレベルは減少しました。は正常領域とAAA領域の間で同様でした（図1h、i）。

a ヒト大動脈の正常領域と腹部大動脈瘤 (AAA) 領域のヘマトキシリンエオシン (HE) 染色。点線の長方形は拡大されて下部に表示されます。 b 正常領域および AAA 領域の Verhoeff Van Gieson 染色。 c 大動脈の正常領域およびAAA領域におけるRhoAの免疫組織化学。点線の長方形は拡大されて下部に表示されます。 d (c)で調べたRhoA発現の概要グラフ。 Normal では n = 6、AAA では n = 9。 e 正常領域および AAA 病変における RhoA の免疫染色。 F-アクチンと核をそれぞれファロイジンとDAPIで対比染色しました。 f (e)で調べたRhoA発現の要約グラフ。ノーマルでは n = 7、AAA では n = 12。 g 正常領域およびAAA領域から得られたRHOA mRNAのqPCR分析。 GAPDHを対照として使用した。ノーマルでは n = 11、AAA では n = 15。 h 正常領域および AAA 領域における RhoA およびその他のマーカータンパク質のウェスタンブロッティング。 GAPDHはローディングコントロールとして機能しました。 i (h) で調べた RhoA およびその他のマーカータンパク質の相対発現の概要グラフ。 Normal では n = 6、AAA では n = 8。スケールバー：500μm（a〜c）および30μm（e）。 (d、f、g、i) では、2 つのグループ間のデータが t 検定によって分析されました。 ***p < 0.001 対正常。

大動脈の内層における RhoA 発現障害が AAA の発症に寄与しているかどうかを調べるために、Cre/loxP システムを使用して VSMC 特異的 RhoA cKO マウスを作製しました。 RhoA cKO マウスは正常な成長を示し、メンデル比で生まれました。これらのマウスは、同腹子対照と比較して、生殖能力を含めた大きな表現型の差異を示さなかった。免疫蛍光染色により、RhoA cKOマウス大動脈の内層にRhoA発現が存在しないことを確認しました（補足図1a）。血行動態研究では、少なくともテールカフ法を使用したスポットチェックによって、対照マウスとRhoA cKOマウスの間で同様の心拍数と収縮期血圧（BP）が示されました（補足図1b）。大動脈の外観は、コントロールマウスとRhoA cKOマウスの両方で明確であり、AAAは形成されませんでした（補足図1c）。超音波検査では、対照マウスと RhoA cKO マウスの間で腹部大動脈径の有意な拡張や差異は検出されませんでした（補足図 1d、e）。さらに、HE および Verhoeff Van Gieson 染色では、コントロールマウスと RhoA cKO マウスの両方で無傷の大動脈が示されました（補足図 1f、g）。 Eln 遺伝子によってコードされるトロポエラスチン、および Fbn1 遺伝子によってコードされるフィブリリン 1 は、大動脈の内層の主要成分であり、大動脈の弾性の調節に役割を果たします 16。 Eln および Fbn1 mRNA のレベルは、両タイプのマウスの大動脈で同様でした（補足図 1h）。さらに、qPCR およびヒドロキシプロリンアッセイにより、大動脈壁の強度に影響を与える可能性があるマウス大動脈サンプルにおけるコラーゲン生成とコラーゲン架橋を調べました。 I 型コラーゲンの主成分である I 型コラーゲン α1 の mRNA レベルは、コントロールと RhoA cKO マウスの大動脈の間で同様でした。ヒドロキシプロリンアッセイは、総コラーゲンと架橋コラーゲンが両方のタイプのマウスの大動脈に同等に含まれていることも示しました（補足図1i、j）。これらの結果は、正常な状態では、VSMC における RhoA の喪失は、少なくとも生後 6 か月間は大動脈の形態および機能に影響を及ぼさないことを示唆しています。

SM22α プロモーター下で駆動される Cre リコンビナーゼの活性がマウスの VSMC と同様に心臓でも観察され 17、そのような cKO マウスの心臓では標的遺伝子の不活化が示されたことが報告されています 18。これらの以前の出版物に基づいて、我々は胚と成体マウスの心臓における RhoA の発現をチェックしました。実際、RhoA cKO マウスの発育期および成体心臓の両方で、対照マウスと比較して RhoA 発現は減少しましたが、完全には失われませんでした（補足図 2a-d）。心臓における RhoA の発現が減少しているにもかかわらず、RhoA cKO 成体マウスの心臓の収縮性と寸法は維持され（補足図 2e）、これは、RhoA cKO マウスにおける心臓 RhoA 発現のある程度の低下は心臓機能に影響を及ぼさないことを示唆しています。

上記の RhoA cKO マウスの結果に基づいて、次に、薬理学的刺激下での VSMC における RhoA の生物学的重要性を調べました。アンジオテンシン II (AngII) と β-アミノプロピオニトリル (BAPN) を、浸透圧ミニポンプを使用して対照マウスと RhoA cKO マウスに 4 週間投与して、AAA を誘導しました。 AngIIとBAPNの投与中に、体重、心拍数、テールカフ法で測定した収縮期血圧の差異は群間で観察されませんでした（図2a）。しかし、AAA形成の発生率は、対照マウスよりもRhoA cKOマウスの方が有意に高かった(表1および図2b)。 AAAが形成された対照マウスをさらに分析したところ、正常領域と比較してAAA領域でRhoA発現が著しく低下していることがわかり（補足図3a〜c）、AAAの予防におけるRhoAの重要性が示唆されています。大動脈の長さは対照マウスとRhoA cKOマウスの間で差はありませんでしたが（図2c）、超音波検査によって測定された腹部大動脈の直径は、対照マウスと比較してRhoA cKOマウスで有意に大きかった（図2d、e）。 HEおよびVerhoeff Van Gieson染色による組織学的分析により、大動脈の内側弾性層の破壊と劣化が、RhoA cKOマウスでは対照マウスよりも重篤であることが示されました（図2f-h）。さらに、ElnおよびFbn1 mRNAレベルは、対照マウスと比較して、RhoA cKOマウスにおけるAng IIおよびBAPN注入後に有意に減少した（図2i）。これまでの研究では、大動脈におけるプロテオグリカン凝集の異常な増加は、細胞-マトリックス相互作用の破壊、大動脈の機械感覚および構造的完全性の低下を引き起こす可能性があり、大動脈の中膜変性の特徴である可能性があることが示唆されています19、20、21。したがって、大動脈におけるアグリカン発現を検出するために免疫染色を行ったところ、RhoA cKOマウスの大動脈破裂部位で発現が大幅に上方制御され蓄積していることがわかりました（図2j）。これらの結果を総合すると、VSMC の RhoA が AAA 形成の刺激に対して保護的な役割を果たしていることが示唆されます。

a AngII および BAPN による治療前 (0 週目) と治療後の体重および血行動態の変化。 n = 14、各グループ。 b 4週間の治療後に摘出された心臓と腎臓を含む大動脈の外観。矢印は形成された AAA を示します。 c 大動脈弁から総腸骨動脈分岐部までの大動脈の長さ。 d 治療後の腹部大動脈の超音波観察（黄色の点線で囲まれた部分）。 e 腹部大動脈直径の概要グラフ。 n = 6、各グループ。 f 大動脈の HE 染色。 g 大動脈のVerhoeff Van Gieson染色。 h (g) で分析されたエラスチン分解グレードの概要グラフ。 n = 5、各グループ。 i 大動脈の弾力性に関連する遺伝子の qPCR 分析。 Elnの場合、コントロールでn = 13、RhoA cKOでn = 10、Fbn1の場合、コントロールでn = 10、RhoA cKOでn = 8。 j 治療後のマウス大動脈におけるアグリカンと α-SMA の共免疫染色。核をDAPIで対比染色した。矢印: AAA 破断の位置 (f、g、j)。スケールバー: 1 mm (d) および 100 μm (f、g、j)。 (a) では、二元配置または一元配置 ANOVA を適用して、グループ間および週間のデータをそれぞれ比較しました。(c、e、h、i) では、2 つのグループ間のデータを t 検定で分析しました。。 †p < 0.05、††p < 0.01、および †††p < 0.001 対 0 週目。 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001 対対照。

次に、大動脈とVSMCの収縮性におけるVSMCにおけるRhoAの役割を調べました。生理食塩水または AngII と BAPN の両方を 4 週間注入した後、摘出したマウス大動脈の等尺性張力をワイヤー筋電計で測定しました。対照マウスの大動脈は、生理食塩水およびＡｎｇＩＩ＋ＢＡＰＮの注入後、マルチワイヤミオグラフによって生じた最高張力に同様のレベルまで抵抗したが、ＲｈｏＡｃＫＯマウスの大動脈は脆弱であり、生理食塩水またはＡｎｇＩＩ＋ＢＡＰＮによる処置に関係なく、より低い大動脈張力を維持した。 AngII+BAPN (図 3a)。また、コントロールおよび RhoA cKO マウス大動脈から単離された VSMC を使用して、in vitro コラーゲンゲル収縮性アッセイも実行しました。 AngII処理とは無関係に、RhoA cKO VSMCを含むコラーゲンゲルの直径の縮小は、対照VSMCを含むゲルの直径の縮小と比較して著しく損なわれることがわかりました（図3b、c）。これらの結果は、RhoA cKO VSMC は対照 VSMC よりも収縮性が低いことを示しています。

a ワイヤミオグラフによって測定された大動脈輪張力の変化。 n = 6、各グループ。 b 生理食塩水またはAngIIでの処理による単離されたマウス大動脈VSMCを使用したインビトロコラーゲンゲル収縮性アッセイ。 c (b)で調べたVSMC含有コラーゲンゲルの直径の概要グラフ。 n = 7 ～ 10、各グループ。 d 4週間の治療後のマウス大動脈におけるα-SMAの免疫染色。 e 生理食塩水またはAngIIで24時間処理した後、α-SMA抗体で染色した大動脈VSMCの免疫蛍光画像。 (d、e)では、F-アクチンと核をそれぞれファロイジンとDAPIで視覚化しました。 f 生理食塩水またはAngIIで24時間処理した後の大動脈VSMCにおけるα-SMAのウェスタンブロット。 GAPDH はローディングコントロールのためにブロットされました。 g (f)で調べたα-SMA/GAPDH比の要約グラフ。 n = 6、各グループ。 h VSMC収縮表現型に関連する遺伝子のqPCR分析。大動脈VSMCを生理食塩水またはAngIIで24時間処理した。 n = 8、各グループ。スケールバー: 2 mm (b)、20 μm (d)、および 50 μm (e)。二元配置 (a、c) または一元配置 (g、h) 分散分析を適用して、グループ間のデータを比較しました。同じ治療における対照との比較 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。 †††p < 0.001 対生理食塩水処理における対照。

次に、α-SMA6 などの VSMC 収縮構造のマーカーを調べることにより、対照と RhoA cKO 大動脈および VSMC をチェックしました。免疫蛍光およびウェスタンブロッティング分析により、RhoA cKO 大動脈および VSMC では、対照と比較して α-SMA 発現が減少していることが示されました（図 3d–g）。さらに、大動脈およびVSMCにおけるRhoAの喪失に応答して、F-アクチンの発現の減少および無秩序な発現が観察されました（図3d、e）。 α-SMA の発現低下と F-アクチンの障害は、対照大動脈の AAA 領域でも見つかりました（補足図 3b）。 qPCRにより、RhoA cKO VSMCでは、対照VSMCと比較して、他の収縮マーカー遺伝子、MylkおよびMyh11、ならびにActa2の発現が有意に減少していることが明らかになった（図3h）。さらにレスキュー実験を行って、α-SMAおよび他のVSMC収縮マーカー遺伝子の発現低下がVSMCにおけるRhoAの喪失に特異的に依存していることを確認した。 GFP-RhoA野生型（WT）をRhoA cKO VSMCで対照VSMCと同様のレベルで再発現させると、α-SMAタンパク質発現が完全に回復し、細胞内で正常なF-アクチン組織化が観察されました（補足図1）。 4a–c)。同様に、RhoA cKO VSMCにおける収縮マーカー遺伝子の発現低下は、GFP-RhoA-WTの再発現によって回復しました（補足図4d）。

大動脈の内層の機能不全と組織崩壊は通常、内皮バリア機能に影響を及ぼし、その逆も同様であるため 22,23、内皮層の形態を調べたところ、AngII+ 投与後の RhoA cKO マウスでは主に AAA 部位で層が破壊されていることが判明しました。 BAPN 治療 (図 4a)。 RhoA cKO 大動脈におけるこの内皮バリア機能の障害は、大動脈壁における色素の蓄積によってさらに確認されました。エバンスブルー色素をマウスに静脈内注射すると、AngII+BAPNで処理したRhoA cKOマウスでは色素の蓄積が大幅に増加しました（図4b、c）。この破壊により、炎症細胞が大動脈壁に浸潤する可能性があります。免疫蛍光染色により、生理食塩水注入では、CD68 および F4/80 マーカーによって測定される炎症細胞浸潤は、コントロールおよび RhoA cKO 大動脈の両方で最小限でしたが、AngII+BAPN による治療に応答して、RhoA cKO 大動脈では浸潤が著しく増加したことが示されました。 (図4d、e)。炎症性サイトカインは、内皮層の破壊と炎症性細胞の浸潤を促進します24。次に、炎症性サイトカインの発現を調査し、試薬の4週間の注入後のRhoA cKO大動脈、およびAngII刺激後の単離されたRhoA cKO VSMCで炎症性サイトカインの発現が増加したことを発見しました（図4f、g）。さらに、RhoA cKO VSMCにおける炎症性サイトカインの発現の増加は、細胞へのGFP-RhoA-WTのトランスフェクションによって逆転した（補足図4e）。これらの結果は、大動脈VSMCにおけるRhoAの喪失が、サイトカイン産生の上方制御を介して血管炎症を増強することを示唆している。

a 抗 CD31 抗体で染色したコントロールおよび RhoA cKO マウス大動脈の免疫蛍光画像。生理食塩水またはAngII+BAPNで4週間処理した後、大動脈を摘出した。 F-アクチンと核は、それぞれファロイジンとDAPIで視覚化されました。矢印と矢じりは、それぞれ内皮の喪失と炎症細胞の浸潤を示します。 b 大動脈の内皮バリア機能を評価するための血管透過性アッセイ。エバンスブルー色素の静脈内注射の 10 分後に、生理食塩水または AngII+BAPN で処理したマウスの大動脈を抽出し、色素の蓄積を測定しました。 c エバンスブルー色素蓄積の平均強度の要約グラフ。 n = 5、各グループ。 d CD68 または F4/80 抗体で染色したコントロールおよび RhoA cKO マウス大動脈の免疫蛍光画像。大動脈は (a) に記載されているように抽出されました。 e 大動脈の中膜におけるCD68陽性領域またはF4/80陽性領域の割合の概要グラフ。 n = 3 ～ 7、各グループ。 f、g マウス大動脈 (f) および大動脈 VSMC (g) における炎症性サイトカインの qPCR 結果のグラフ。 (a) に記載されているように大動脈を抽出し、VSMC を生理食塩水または AngII で 24 時間処理しました。 n = 3 ～ 6、各グループ。スケールバー: 30 μm (a、d) および 1 mm (b)。 (c、e、f、g) では、一元配置分散分析を適用してグループ間のデータを比較しました。同じ治療における対照との比較 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。生理食塩水処理における RhoA cKO と比較した場合、†p < 0.05、††p < 0.01、および †††p < 0.001。

RhoA cKO 大動脈におけるエラスチン破壊の増加に関する潜在的なメカニズムをさらに調査するために、細胞外マトリックス (ECM) タンパク質破壊における重要なプロテイナーゼである MMP2 および MMP9 の発現を調べました。 AngII刺激された培養VSMCにおけるMmp2 mRNAレベルは、対照よりもRhoA cKOで有意に高かった（補足図5a）。免疫染色により、AngIIおよびBAPNでの治療後、大動脈におけるMMP2発現が対照マウスと比較してRhoA cKOマウスで増加したことが示された（補足図5b、c）。 MMP9発現についても同様の結果が得られた(補足図5a、d、e)。対照的に、MMPの内因性阻害剤であるメタロプロテイナーゼ1の組織阻害剤1（TIMP1）およびTIMP2の発現は、培養VSMCおよびRhoA cKOマウスの大動脈では著しく減少し（補足図5f-j）、両方がMMPを増加させたことを示唆していますTIMP の発現と、TIMP の発現低下による活性の増強は、RhoA cKO マウスの大動脈における AAA 形成のための ECM の強力な分解に協調して寄与します。ヒト大動脈組織サンプルを使用したザイモグラフィーでも、AAA病変では正常領域よりも多量のプロおよび成熟MMP2およびMMP9が検出されました（補足図5k、l）。これらのデータは、RhoA が MMP の発現と活性化を阻害し、その結果、薬理学的刺激後の対照マウスの大動脈における ECM 異常が減少することを示しています。

次に、大動脈のVSMCにおける炎症とMMPの発現に関与するシグナル伝達経路を調査しようとしました。これまでの研究では、細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) や p38 などのマイトジェン活性化タンパク質 (MAP) キナーゼシグナル伝達因子が上記の現象を調節していることが示されています 25,26。そこで、ERK1/2とp38の活性（リン酸化レベル）を調べました。リン酸化ERK1 / 2およびp38の免疫蛍光シグナルは、4週間のAngII + BAPN治療後、対照大動脈と比較してRhoA cKO大動脈で増加しました（図5a〜d）。この増加は、AngIIで刺激されたVSMCでも観察されました（図5e、f）。 MAP キナーゼの活性を制御する分子をさらに調べるために、我々は MAP4K427,28 に焦点を当てました。MAP4K427,28 は、血管炎症や心筋細胞の収縮にも関連しています 29,30。薬理学的刺激によるMAP4K4の活性化（リン酸化）は、RhoA cKOマウスの大動脈および単離されたVSMCにおいて、対照マウスよりも有意に高かった（図5g-j）。さらに、RhoA cKO VSMCにおけるMAPキナーゼシグナル伝達経路のAngII誘発性の増強は、GFP-RhoA-WTの再発現によって対照VSMCのレベルに戻った（補足図4f、g）。リン酸化された ERK1/2、p38、および MAP4K4 免疫染色に対する抗体の特異性は、阻害剤投与後の RhoA cKO 大動脈を使用した実験によって検証されました。 AngII + BAPN処理によって明確に検出されたリン酸化ERK1 / 2、p38、およびMAP4K4のシグナルは、各MAPキナーゼシグナル伝達分子の阻害剤の存在下で消失しました（補足図6）。ヒト大動脈では、MAP4K4の活性化は正常領域と比較してAAA病変で強化され（図5k-n）、対照マウスでもAAA部位で活性化の強化が観察されました（補足図3d）、e）。これらの結果は、VSMC 内の RhoA が MAP キナーゼシグナル伝達カスケードを弱めて AAA 形成を防止する可能性があることを示唆しています。

a、c、g、k AngII + BAPN で 4 週間処理した後のコントロールおよび RhoA cKO マウス大動脈 (a、c、g) およびヒト大動脈の正常領域および AAA 領域 (k) の免疫蛍光画像。 F-アクチンと核は、それぞれファロイジンとDAPIで視覚化されました。 b、d、h、l 各 MAP キナーゼシグナル伝達分子の陽性領域のパーセンテージをまとめたグラフ。対照では n = 9、RhoA cKO では n = 10 (b)、対照では n = 8、RhoA cKO では n = 10 (d)、および n = 5、各グループ (h、l)。 e、i 生理食塩水またはAngIIで24時間処理した後の培養大動脈VSMCを使用した、示された抗体によるウェスタンブロット。 GAPDHはローディングコントロールとして機能しました。 f、j 各グループのリン酸化/総MAPキナーゼシグナル伝達分子の比率をまとめたグラフ。 n = 3 ～ 5、各グループ。 m ヒト大動脈の正常領域およびAAA領域におけるP-MAP4K4および総MAP4K4のウェスタンブロッティング。 n P-MAP4K4/MAP4K4 比率の概要グラフ。 n = 4、各グループ。スケールバー: 20 μm (a、c、g、k)。 (b、d、h、l、n) では、2 つのグループ間のデータを t 検定によって分析し、(f、j) では、一元配置分散分析を適用してグループ間のデータを比較しました。 *p < 0.05 および ***p < 0.001 対対照または正常; 生理食塩水処理における RhoA cKO に対して †p < 0.05 および †††p < 0.001。

さらに、MAP4K4阻害剤DMX-5804を使用して、VSMC RhoAの非存在下でのAAA形成に対するMAP4K4活性の重要性を評価しました。 RhoA cKO マウスにおいて、AngII および BAPN に加えて DMX-5804 を静脈内投与すると、AAA 形成が大幅に減少し、血行動態に変化はありませんでした（表 2、図 6a および補足図 7a）。組織学的分析により、DMX-5804治療により、DMX-5804で治療された対照大動脈と同様に、RhoA cKO大動脈の有害な形態と劣化が逆転することが示されました（図6b-d）。また、DMX-5804治療は、RhoA cKOマウスおよび対照マウスの心臓機能および血漿量に影響を及ぼさないことも確認されました（補足図7b、c）。さらに、RhoA cKOマウスの大動脈緊張がDMX-5804によるMAP4K4阻害によって回復することを発見しました（図6e）。単離されたVSMCを使用したコラーゲンゲル収縮性アッセイも同様の結果を示し（図6f）、AngIIで処理されたVSMCにおけるα-SMA発現の減少とF-アクチン組織の乱れを伴う形態異常は、DMX-5804によって逆転されました（図6g）。

a 0.5% DMSO (溶媒) または DMX-5804 (DMX) の存在下で AngII および BAPN で 4 週間処理した後に抽出された心臓および腎臓を含む大動脈の外観。矢印は形成された AAA を示します。 b 大動脈の HE 染色。 c 大動脈のVerhoeff Van Gieson染色。 d (c)で分析されたエラスチン分解グレードの概要グラフ。 n = 7 ～ 11、各グループ。 e ワイヤーミオグラフによって測定された大動脈輪張力の変化。 AngII+BAPN + Vehicle では n = 10、AngII+BAPN + DMX では n = 6。 f in vitro コラーゲンゲル収縮性アッセイにおける大動脈 VSMC 含有コラーゲンゲル直径の変化。 AngII+Vehicle では n = 10、AngII+DMX では n = 8。 g ビヒクルまたは DMX-5804 の存在下で AngII で 24 時間処理した後、α-SMA 抗体で染色した大動脈 VSMC の免疫蛍光画像。 F-アクチンと核は、それぞれファロイジンとDAPIで視覚化されました。 h、j AngIIまたはDMX-5804の有無にかかわらず24時間処理した後の大動脈VSMCを使用した、示された抗体によるウェスタンブロット。 GAPDHはローディングコントロールとして機能しました。 i、k P-MLC2/MLC2、P-MYLK/MYLK、および MYLK/GAPDH 比の要約グラフ。 n = 4 (i)、n = 3 ～ 4 (k)、各グループ。 l 示された抗体を使用した免疫沈降実験。 IgG を免疫沈降のネガティブコントロールとして使用しました。 m AngIIおよび/またはDMX-5804の有無にかかわらず24時間処理したVSMCを使用したqPCR分析。 n = 4 ～ 5、各グループ。スケールバー: 500 μm (b、c) および 20 μm (g)。一元配置 (d、i、k、m) または二元配置 (e、f) の ANOVA を適用して、グループ間のデータを比較しました。 *p<0.05、**p<0.01および***p<0.001対ビヒクルまたは対照； DMX-5804 を使用しない AngII 治療との比較では、††p < 0.01 および †††p < 0.001。 §p < 0.05 vs. 無治療。

VSMC の収縮性はミオシン軽鎖 2 (MLC2) のリン酸化レベルに大きく依存するため、ウェスタンブロッティングによって VSMC のレベルを調べました。 AngII 刺激後、対照 VSMC ではリン酸化 MLC2 が増加しましたが、RhoA cKO VSMC では増加は検出されませんでした。 RhoA cKO VSMCをDMX-5804で処理すると、対照VSMCと同様のMLC2のリン酸化レベルが回復しました（図6h、i）。 MLC2 のリン酸化は、2 つの酵素の機能のバランスによって制御されます。MLC2 のリン酸化を誘導するミオシン軽鎖キナーゼ (MYLK) と、MLC2 を脱リン酸化し、ROCK によって強く阻害されるミオシン軽鎖ホスファターゼ (MLCP) です。。 RhoA cKO VSMCでは、MYLK発現が減少し、これは図3hのmRNAの結果と一致し、リン酸化MYLK（MYLKの不活化型）は、MYLKの発現が減少しても増加しました（図6j、k）。 RhoA の喪失による MYLK のリン酸化の亢進は、DMX-5804 による処理によってブロックされました。さらに、免疫沈降アッセイは、MAP4K4がMYLKと相互作用することを示した(図6l)。これらの結果は、MAP4K4 が MYLK をリン酸化して不活性化し、MLC2 リン酸化の阻害につながることを示唆しています。さらに、RhoA cKO VSMCにおけるMyh11およびActa2の発現低下がDMX-5804処理によって回復することを観察しました（図6m）。まとめると、これらのデータは、VSMC 収縮性の調節における MAP4K4 の関与を示しています。

炎症および MAP キナーゼシグナル伝達に対する DMX-5804 の阻害効果を、マウス大動脈サンプルおよび VSMC で調べました。 DMX-5804による追加治療により、RhoA cKOマウス大動脈におけるF4/80およびMMP2の発現レベル、ならびにMAP4K4のリン酸化が有意に減少した（補足図8a、b）。ウェスタンブロット分析により、VSMCにおけるDMX-5804によるMAP4K4の阻害により、血管炎症およびECM分解に関連するp38およびERK1 / 2シグナル伝達のAngII誘発活性化が減少することが示されました（補足図8c、d）。実際、AngII処理後のRhoA cKO VSMCにおける炎症性サイトカインの発現増加はDMX-5804によって有意に抑制され（補足図8e）、RhoA cKO VSMCにおけるMMPおよびTIMP発現のAngII媒介変化はDMX-5804によって完全にキャンセルされた。 (補足図8f)。まとめると、これらの結果は、RhoA を欠く VSMC における MAP4K4 の阻害が AAA 形成を抑制し、VSMC の収縮性を回復し、MAP キナーゼシグナル伝達の不活性化を通じて血管炎症と ECM 分解を軽減することを示しています。

RhoA が VSMC における MAP4K4 活性を調節する分子機構を調べるために、免疫沈降と質量分析 (MS) を実施しました。 GFP-RhoA 野生型 (WT) または GFP コントロールベクターでトランスフェクトされた RhoA cKO VSMC を AngII で刺激し、その後細胞溶解物を抗 GFP 抗体で免疫沈降し、その後クーマシーブリリアントブルー (CBB) で免疫沈降剤を検出しました。）染色（図７ａ）。 GFP-RhoA-WT と免疫共沈降したが、GFP とは共沈降しなかったタンパク質を、液体クロマトグラフィー (LC)-MS/MS によって分析しました。分析により、359 のタンパク質に属する 1453 のペプチドが同定されました (補足データ 1)。最近、MAP4K4 活性は、RhoA33,34 の下流にあるストリアチン相互作用ホスファターゼおよびキナーゼ (STRIPAK) 複合体によって制御されていることが報告されました。この報告に基づいて、我々は 359 個のタンパク質に対して in silico 解析を実行し、STRIPAK 複合体の成分と優先的に相互作用できるタンパク質を特定しました。我々は、Set (アクセッション番号 Q9EQU5) が、MAP4K4 のリン酸化を減少させることで MAP4K4 活性を負に制御する STRIPAK コンポーネントであるプロテインホスファターゼ 2A (PP2A) への結合スコアが最も高いことを発見しました。以前の研究では、Set が PP2A と結合してそのホスファターゼ活性を阻害すること 35,36 と、もう 1 つの Rho ファミリー GTPase である Rac1 のシグナル伝達を調節することも示されました 37。

a GFP または GFP-RhoA-WT 発現プラスミドのトランスフェクション後、VSMC を AngII で 24 時間刺激しました。細胞抽出物を抗GFP抗体で免疫沈降および免疫ブロットし(上のパネル)、抗GFP抗体に対する免疫沈降タンパク質をクーマシーブリリアントブルー(CBB)染色によって検出した(下のパネル)。一重鎖と二重星: それぞれ IgG 重鎖と軽鎖。矢印: トランスフェクトされた GFP または GFP-RhoA-WT。赤い点線の長方形で囲まれたバンドを LC-MS/MS によってさらに分析しました。 b スクランブルまたはsiSet siRNAでトランスフェクトされた大動脈RhoA cKO VSMCにおけるP-MAP4K4およびMAP4K4のウェスタンブロット。 c P-MAP4K4/MAP4K4 比率の概要グラフ。 d 生理食塩水またはAngII処理後の対照VSMCからの細胞抽出物を、mDiaのGTP結合RhoA結合ドメインを含むGST融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイに使用し、続いて抗Setまたは抗RhoA抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。 e コントロールまたは RhoA cKO VSMC を AngII で 24 時間刺激した後、細胞抽出物を抗 PP2A 抗体またはコントロール IgG で免疫沈降し、続いて指定の抗体でウェスタンブロッティングを行いました。 f AngIIで24時間処理した後、示された抗体で染色されたコントロールまたはRhoA cKO VSMCの免疫蛍光画像。核はDAPIで視覚化されました。スケールバー: 20 μm。 g、j スクランブルまたはsiSet siRNAによる細胞のトランスフェクションおよび24時間のAngII刺激後、対照またはRhoA cKO VSMCの細胞抽出物を、示された抗体で免疫ブロットした。 h、k リン酸化/総MAPキナーゼシグナル伝達分子比(h)およびP-MLC2/MLC2、P-MYLK/MYLK、およびMYLK/GAPDH比(k)のまとめグラフ。 n = 3 (h) および n = 4 ～ 5 (k)、各グループ。 iスクランブルまたはsiSet siRNAでトランスフェクトされたAngII刺激RhoA cKO VSMCを使用したVSMC含有インビトロコラーゲンゲル収縮性アッセイの概要グラフ。 n = 8、各グループ。データは、グループを比較するために、t 検定 (c)、一元配置分散分析 (h、k)、または二元配置分散分析 (i) によって分析されました。 (c) では、***p < 0.001 対スクランブル。 (h, k) では、対照に対して **p < 0.01 および ***p < 0.001、スクランブルに対して ††p < 0.01 および †††p < 0.001。 (i) では、*p < 0.05 対スクランブル。

次に、Setが実際にMAP4K4活性の制御に寄与しているかどうかを判断するために、AngII刺激を伴うRhoA cKO VSMCでノックダウン実験を実行し、Set siRNAトランスフェクションがMAP4K4のリン酸化を有意に減少させることを発見しました（図7b、c）。次に、VSMCにおけるAngII刺激に応答して、AngII誘導性の活性化RhoAとSetの相互作用が増加し、これによりSetがPP2Aから解離し、遊離PP2AがMAP4K4に結合してMAP4K4の活性化を阻害できるのではないかという仮説を立てた。この仮説と一致して、SetとGTP結合RhoAの相互作用は、AngII刺激後のVSMCで増加しました（図7d）。 AngIIで刺激された対照VSMCでは、PP2AとMAP4K4の会合が観察され、この会合はPP2A-Set結合によるRhoAの喪失によって損なわれ（図7e左パネルおよび図7f）、これによりMAP4K4自己リン酸化が引き起こされる38。さらに、RhoA cKO VSMCでSetがノックダウンされると、PP2AとMAP4K4の間の関連が回復しました（図7e右パネル）。対照的に、対照 VSMC に HA タグ付き Set アイソフォーム 1 およびアイソフォーム 2 (HA-Set1 および HA-Set2) をトランスフェクトし、AngII で刺激した場合、PP2A-Set 結合は増加し、PP2A-MAP4K4 結合は HA タグの存在下でも減少しました。 RhoAの（補足図9a）、RhoAの下流のSet、PP2AおよびMAP4K4間のバランスのとれた機能的な分子相互作用を示唆しています。

最後に、MAP4K4 活性化の Set 媒介制御が MAP キナーゼの活性化と MAP4K4 の下流の VSMC 収縮性に関与していることを確認しました。 AngII刺激下では、ERK1 / 2およびp38、ならびにMAP4K4のリン酸化は、Setの追加のノックダウンによってRhoA cKO VSMCでは増加しませんでした（図7g、h）。一貫して、siSetトランスフェクションを行ったRhoA cKO VSMCでは、VSMCの収縮性が維持され、MLC2のリン酸化が回復し、MYLKのリン酸化は増加しませんでした（図7i-k）。 HA-Set1 および HA-Set2 でトランスフェクトされた AngII 刺激対照 VSMC では、空のプラスミドでトランスフェクトされた VSMC と比較して、リン酸化 MAP4K4、ERK1 / 2、および p38 が大幅に増加しました（補足図 9b、c）。さらに、HA-Set1およびHA-Set2の過剰発現はMLC2のリン酸化を抑制し、MYLKの不活化（リン酸化）を促進しました（補足図9d、e）。これは、豊富なSet- PP2AからのMAP4K4の解離を媒介する。総合すると、これらの結果は、RhoA が Set および PP2A を介して MAP4K4 活性化を負に制御し、その結果、VSMC および大動脈の収縮性と形態が維持されることを示唆しています。

この研究では、ヒト大動脈組織、RhoA cKO マウスモデル、および in vitro アプローチを使用して、VSMC における RhoA の AAA 形成に対する保護効果を特定しました。 RhoA の喪失は、VSMC の収縮性の機能不全と血管炎症の増強の両方に関与します。これらの結論は、以下の結果に基づいています：（1）ヒト AAA 病変では RhoA 発現が著しく減少した、（2）AngII および BAPN で治療された RhoA cKO マウスでは AAA 形成が増加した、（3）VSMC 収縮関連遺伝子発現が減少したRhoA の喪失により、炎症性サイトカインの発現に伴う VSMC 収縮性の低下が誘導された、(4) RhoA cKO マウス大動脈では炎症性細胞浸潤と内皮機能不全が増強された、(5) RhoA 枯渇は MMP 活性の増加と減少によって決定される ECM 分解を誘導したTIMP 活性、および (6) MAP4K4 媒介 MAP キナーゼカスケードは、RhoA 欠損大動脈および VSMC で活性化されました。

AAA とは性質が異なる胸部大動脈瘤において、RhoA の GAP や GDP 解離刺激因子などの RhoA 調節因子の関与がいくつかの報告で示されている 39,40 が、RhoA 自体が AAA を予防する素因分子として認定されていない。この研究で明らかになりました。また、VSMC の RhoA が、Acta2 や Myh11 などの力生成遺伝子の発現や、Il1b や Ccl2 などのサイトカイン/ケモカイン遺伝子の転写の抑制に重要であることもわかりました。したがって、VSMCにおけるRhoAの枯渇は、VSMCの収縮性の低下に加えて、そのようなサイトカイン/ケモカインの発現を促進し、大動脈の中膜に炎症細胞を補充します。大動脈壁に蓄積した炎症細胞も豊富な MMP を産生し、その活性化を促進し、壁の脆弱性をもたらします 41。これらの現象は、AAA の誘発に決定的に寄与している可能性があります。

内皮細胞の MAP4K4 は血管の炎症を促進します 30。 MAP4K4 は MAP キナーゼシグナル伝達経路の上流調節因子として機能し、MAP4K4 が枯渇すると経路と炎症が抑制されます 27,42。この研究では、VSMC における RhoA と MAP4K4 の関連性を特定し、この関連性が AAA の予防に重要であることを発見しました。 RhoA の存在下では、AngII 刺激後でも MAP4K4 および MAP キナーゼの活性が阻害され、炎症が軽減されました。対照的に、VSMC に RhoA が存在しない場合、MAP4K4 活性が上方制御され、AAA 形成の発生率が大幅に増加しました。 RhoA cKO マウスおよび RhoA 枯渇 VSMC において MAP4K4 活性が DMX-5804 によって減弱された場合、MYLK および MLC2 活性ならびに Acta2 および Myh11 発現の誘導により、MAP4K4 媒介炎症反応だけでなく血管収縮性も明らかに回復しました。さらに、RhoA の喪失によって誘導される AAA 形成は、DMX-5804 処理によって完全に阻害されました。これは、RhoA が MAP4K4 にシグナルを伝達してその活性を阻害すること、およびその阻害が AAA 形成に対する保護効果を有することを示しており、MAP4K4 が AAA に対する治療標的である可能性があることを示唆しています。

私たちの研究のさらなる発見は、RhoA と MAP4K4 活性を調節する分子複合体 STRIPAK を結び付けるシグナル伝達分子の同定です。以前の研究では、活性型 GTP 結合 RhoA が、STRIPAK 複合体のホスファターゼである PP2A を介して MAP4K4 の活性化 (リン酸化) を抑制することが示されました 34。しかし、RhoA がどのように PP2A 機能を調節するのかは不明でした。 RhoA と PP2A の両方に関連する分子を同定するために、AngII 刺激 VSMC を使用してプルダウンアッセイと LC-MS/MS を実行しました。 LC-MS/MS 後の in silico 分析により、Set が関連性の候補であることが判明しました。さらに、免疫沈降によって分子会合を確認したところ、活性化されたRhoAが優先的にSetに結合し、これによりSetがPP2Aから解離されることが判明した。 Set は PP2A のサプレッサーであるため 35,36、PP2A からの Set の解離は PP2A 活性化とそれに続く MAP4K4 阻害を誘導します。逆に、RhoA cKO VSMC で Set をノックダウンすると、MAP4K4 およびその下流 MAP キナーゼのリン酸化の増加がキャンセルされ、AngII 処理の存在下で VSMC の収縮性が回復しました。これらの結果は、Set が AAA に対する別の治療標的となる可能性があることを示しています。結論として、この研究の結果は補足図10に概略的にまとめられています。

AAA に関する研究は増え続けていますが、この壊滅的な血管疾患の治療法は依然として限られています 43,44。 AAA は生命を脅かす進行性の血管疾患で、静かに進行し、多くの場合大動脈破裂による突然死を引き起こします。したがって、AAA 形成の進行を抑制するには、早期診断と新しい治療法の発見が必要です。これまでの研究では、VSMC の遺伝的障害が AAA2 において重要な役割を果たしていることが示されています。この点において、本研究は、RhoAが力生成タンパク質を調節して大動脈収縮性を維持し、MAP4K4によって媒介される血管炎症を阻害することを示し、AAA病理の現在の理解をさらに深めるものである。さらなる研究が必要ではあるが、RhoA は AAA の診断バイオマーカーである可能性があり、大動脈の VSMC におけるその発現の維持が AAA の形成とこの疾患の予後に対抗するために重要であると我々は推測している。

この研究の限界の 1 つは、AAA 形成が RhoA cKO マウスにおける AngII と BAPN の薬理学的刺激によって誘導されたのに対し、ヒトの AAA は一般的に加齢および/またはアテローム性動脈硬化を介した高血圧と大動脈壁の結果によって形成されることである可能性があります。脆弱性45、46。基礎条件では、対照マウスと RhoA cKO マウスの間に違いは見つかりませんでした。 RhoB などの他の Rho ファミリーメンバーの発現増加が、大動脈の内層における RhoA の損失を補って大動脈構造を正常に維持している可能性があります。 AngII および BAPN の投与が動物 AAA モデルの作成によく使用されることを考慮すると、AAA 形成のプロセスおよび機構における RhoA などの標的分子の機能の研究には、これらの試薬の利用が許容される可能性があります。 RhoA cKO マウスの加齢により AAA 形成が促進されるかどうかをさらに調べることは興味深いかもしれません。時間がかかりすぎるため、今回の研究の対象外となるため、今後の実験研究計画となる。

結論として、我々は、VSMC RhoA が cKO マウスモデルにおける AAA 形成に対抗することを示すことに成功し、RhoA が Set を介して MAP4K4 活性を抑制して AAA を防ぐメカニズムを明らかにしました。翻訳的および臨床的意義に関しては、MAP4K4 阻害剤 DMX-5804 は、VSMC における RhoA の喪失によって誘発される AAA 形成の有害現象を逆転させ、RhoA 発現と MAP4K4 活性が著しく低下した AAA に対するこの阻害剤の治療的可能性を提供しました。現在、AAA に対する効果的な薬物治療がないため、これは貴重な発見です。

ヒト大動脈サンプルを使用するすべてのプロトコルは、滋賀医科大学の研究倫理委員会によって承認されており、ヘルシンキ宣言に概説されている原則に準拠しています。大動脈組織は、手術後に AAA 患者から採取されました。患者の臨床的特徴を補足表 1 にまとめました。すべての患者は、この研究での大動脈組織の使用について書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

我々は、胚性幹（ES）細胞におけるRhoA対立遺伝子の相同組換えによってRhoAフロックスマウスを作製した。標的ベクターには、loxP 部位と neo 遺伝子が隣接する RhoA 遺伝子のエクソン 3 が含まれていました。 ES 細胞をベクターでトランスフェクトし、G418 で処理することによって選択しました。 neo 遺伝子は Cre リコンビナーゼの一過性投与により除去されました。 neoを持たないRhoA-flox化対立遺伝子を有するES細胞を胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを作製した。キメラマウスをB6D2F1マウス(日本CLEA、東京、日本)とさらに交配して、RhoA-flox化対立遺伝子についてヘテロ接合性のマウスを得た。ヘテロ接合マウスをC57BL/6系統に少なくとも6回戻し交配し、雄と雌の両方のヘテロ接合マウスを交配して、RhoA-flox化対立遺伝子についてホモ接合のマウスを得た。次に、ホモ接合マウスを、Jackson Laboratory (バーハーバー、メイン州、米国) から購入した C57BL/6 株上で SM22α プロモーター駆動 Cre リコンビナーゼ (SM22α-Cre) を発現するトランスジェニックマウスと交配させました。ヘテロ接合性 RhoA-flox 対立遺伝子と Cre 遺伝子の両方を持つ子孫を再びホモ接合性 RhoA-flox マウスと交配させて、VSMC 特異的 RhoA cKO マウスを生成しました。 Cre遺伝子を持たない同腹子マウスを対照として使用した。この研究では合計 106 匹のマウス (10 ～ 14 週齢の雄マウス、対照 n = 47、RhoA cKO n = 59) を使用しました。 Cre および RhoA で flox 化された対立遺伝子を持つマウスを検出するためのジェノタイピング用のプライマーは次のとおりです: Cre、順方向 5'-ACCTCTGGGAACTGGTCCTT-3' および逆方向 5'-AGTTACCCCCAGGCTAAGTGC-3'。 RhoA フロックス化、順方向 5'-TCTTAACCGCTGAGCCATCT-3' および逆方向 5'-ACCTCTGGGAACTGGTCCTT-3'。

マウスに AAA を誘導するために、浸透圧ミニポンプ (ALZET モデル 1004; Durect Corp.、クパチーノ、カリフォルニア州、米国) を使用して、AngII (1000 ng/kg/分) および BAPN (37.5 mg/kg/日) を 4 週間投与しました。前述したように、いくつかの変更を加えます49。マウスはイソフルラン (1.0 ～ 1.5%) で麻酔されました。滅菌生理食塩水に溶解したAngIIとBAPNをそれぞれ満たした2つのミニポンプを、首の後ろの小さな切開を通して皮下空間に埋め込んだ。生理食塩水のみを充填したポンプを対照として使用した。切開部位は縫合で閉じられ、感染することなく急速に治癒しました。一部のマウスには、0.5% ジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解した MAP4K4 阻害剤 DMX-5804 (2.5 mg/kg) を尾静脈から週 3 回、4 週間静脈内投与しました。大動脈の直径および心臓の収縮性と寸法は、イソフルラン（1.0〜1.5％）麻酔下で超音波検査（Vevo 2100; VisualSonics Inc.、トロント、カナダ）によってモニタリングされました。すべての動物実験は、滋賀医科大学動物管理使用委員会によって承認され、In Vivo Experiments Animal Research Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) ガイドラインを含む関連ガイドラインおよび規制に従って実施されました。

動脈血圧は、体積脈波尾部カフ法（モデル BP-98-AL、Softron、東京、日本）を使用して、意識のあるマウスで毎週測定されました。血圧測定前および血圧測定中に、マウスを円筒形サーモスタット内で37℃で少なくとも5〜10分間加温した。血圧は 2 分間隔で測定され、7 回の定常状態測定の平均が各マウスの血圧として使用されました50。

マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、大動脈を冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）および10％リン酸緩衝ホルマリンで生理的圧力で毎回5分間連続して灌流した。抽出したマウスおよびヒトの大動脈サンプルを 10% リン酸緩衝ホルマリンで 24 時間固定し、パラフィンに包埋しました。断面（厚さ 4 μm）を作成し、脱パラフィンしました。 HE 染色を行って大動脈の形態を検出しました。ヴァーヘフ・ファン・ギーソン染色では、ホルマリン固定し、脱パラフィンした切片をヴァーヘフ溶液で 1 時間インキュベートし、ヴァン・ギーソン溶液で対比染色し、すぐに脱水してスライドガラスに載せました。内側弾性層の劣化は、劣化の等級付け（劣化なし、軽度の劣化、重度の劣化、および大動脈破裂）によって分析された51。

この研究で使用された一次抗体の詳細情報は、補足表 2 にまとめられています。

ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト大動脈サンプルを切片化し、脱パラフィン処理しました。サンプルを、90 ～ 100 °C で予熱した抗原賦活化溶液 (1 mmol/L クエン酸、0.05% Tween 20、pH 6) に 20 ～ 30 分間浸し、室温で冷却しました。すべての切片の内因性ペルオキシダーゼ活性を 3% 水素ペルオキシダーゼを使用してクエンチし、サンプルを 3% ウシ血清アルブミン (BSA) でブロックした後、抗 RhoA 抗体と一晩インキュベートしました。 PBS で洗浄した後、サンプルをビオチン結合二次抗体 (1:200 希釈、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) とともに室温で 1 時間インキュベートし、続いてストレプトアビジンペルオキシダーゼ (Nacalai Tesque、京都、日本）30分アビジン-ビオチン複合体は、Strep ABC ペルオキシダーゼキット (ナカライテスク) で検出されました。サンプルをヘマトキシリンで対比染色し、続いて脱水ステップを行いました。

ヒトおよびマウスの大動脈サンプル、およびマウス成体心臓サンプルの凍結切片を 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で 10 分間固定し、その後、PBS で各回 5 分間 3 回洗浄しました。サンプルを PBS 中の 0.2% Triton X-100 で 30 分間透過処理し、非特異的染色を避けるために室温で 3 ～ 5% BSA で 30 分間ブロックした後、一次抗体と 4 °C で一晩インキュベートしました。蛍光色素標識二次抗体 (Alexa Fluor 488 および Alexa Fluor 555、1:200 ～ 1000 希釈、Thermo Fisher Scientific)、ローダミンファロイジン (1:600 希釈、Thermo Fisher Scientific)、および Alexa Fluor 488/647 ファロイジン (1) ：６００希釈、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で１時間適用した。サンプルを PBS で各回 5 分間 3 回洗浄し、核染色用の DAPI (Dojindo、熊本、日本) を含む封入液とともにインキュベートしました。免疫蛍光画像は、共焦点顕微鏡（FV-1000; Olympus、東京、日本、または Leica SP8; Leica Microsystems、Wetzlar、ドイツ）によって撮影されました。

マウス胚の染色では、E11.5 の胚を 100% メタノールで 4 °C で一晩固定しました。心臓を抽出し、0.5% Triton X-100 (PBST) を含む PBS 中の 50% メタノールで 4 °C で 30 分間洗浄し、続いて PBST で 4 °C で 30 分間洗浄しました。サンプルを PBST 中の 1% ミルクで 4 °C で 20 分間ブロックし、RhoA およびα-ミオシン重鎖 (α-MHC) に対する一次抗体とともに 4 °C で 48 時間インキュベートしました。次に、それらを PBST で 3 回洗浄し、蛍光色素標識二次抗体とともに 4 °C で 48 時間インキュベートしました。最後に、それらをＰＢＳＴで３回洗浄し、光学的透明化のためにベンジルアルコール：安息香酸ベンジル（２：３）溶液とともにインキュベートした。免疫蛍光画像は、Leica SP8 共焦点顕微鏡によって撮影されました。

リン酸化（活性化）MAP キナーゼシグナル伝達分子の免疫染色に使用される抗体の特異性を検証するために、AngII および BAPN による 4 週間の治療後の RhoA cKO マウスに以下の阻害剤を投与しました: ERK 阻害剤の場合は PD-98059、SB-203580 p38 阻害剤の場合は DMX-5804、MAP4K4 阻害剤の場合は DMX-5804 です。各阻害剤を 0.5% DMSO に溶解し、阻害剤溶液 100 μL（PD-98059：10 mg/kg、SB-203580：5 mg/kg、DMX-5804：2.5 mg/kg）を静脈内投与した。 RhoA cKO マウスの尾静脈。０．５％ＤＭＳＯの溶媒をビヒクルとして他のマウスに静脈内注射した。注射の 30 分後、大動脈を採取し、凍結切片を免疫染色用に準備しました。

TRIzol RNA 単離試薬 (Thermo Fisher Scientific) を使用して、ヒトおよびマウスの大動脈およびマウス VSMC から全 RNA を単離しました。 cDNAは、gDNA Removerを備えたReverTra Ace qPCR RT Master Mix（東洋紡、大阪、日本）によって合成されました。逆転写後、LightCycle Instrument (Roche Diagnostics、バーゼル、スイス) を使用して定量的リアルタイム PCR を実行しました。リアルタイム PCR データは標準曲線法によって定量化され、ヒトまたはマウスの GAPDH mRNA 発現レベルが内部対照として機能しました。プライマーは補足表 3 に示されています。

EGFP タグ付き RhoA-WT の発現プラスミドは事前に調製されました 52。マウス Set アイソフォーム 1 (Set1) およびアイソフォーム 2 (Set2) の cDNA は、マウス大動脈 VSMC から抽出した RNA を使用した逆転写 PCR によって取得しました。 cDNAを増幅するためのプライマーは次のとおりでした：Set1、Forward 5'-GGGGAATTCGCCCCGAAGCGGCAGTCTGCGAT-3'およびReverse 5'-GGGCTCGAGCTAATCATCCTCGCCTTCGTCCTCCT-3'。セット 2、順方向 5'-GGGGAATTCTCTGCGCCGACGGCCAAAGCCAG-3' および逆方向 5'-GGGCTCGAGCTAATCATCCTCGCCTTCGTCCTCCT-3'。各cDNAをEcoRIおよびXhoI制限酵素で消化し、Ligation High Ver.2（東洋紡、大阪、日本）でライゲーションすることにより、pCMV-HA発現プラスミド（タカラバイオ、草津、日本）にサブクローニングしました。プラスミドに挿入されたcDNAの配列は、Prism 3100xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems、Waltham、MA、USA）によって確認されました。

ヒトおよびマウスの大動脈、およびマウスの心臓を、放射免疫沈降アッセイ (RIPA) 緩衝液 (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7.5]、150 mmol/L NaCl、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)) 中で機械的に均質化しました。、１％ノニデットＰ−４０、１μｇ／ｍＬアプロチニン、１μｇ／ｍＬロイペプチン、１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニル、５ｍｍｏｌ／Ｌフッ化ナトリウム、および１ｍｍｏｌ／Ｌオルトバナジン酸ナトリウム）。 VSMC も RIPA バッファーで溶解しました。溶解物を 14,000 rpm で 15 分間遠心分離し、上清をさらなる実験に使用しました。タンパク質サンプルは、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE) によって分離され、ポリ二フッ化ビニリデン膜 (Bio-Rad Laboratories、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ) に転写されました。次にメンブレンを、Tween 20 を含む 5% BSA またはトリス緩衝生理食塩水中の 5% スキムミルク中で室温で 1 時間ブロックしました。メンブレンを 5% スキムミルク中で 4 °C で一晩一次抗体とインキュベートし、続いてインキュベートしました。西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 標識二次抗体 (GE Healthcare、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ) を 5% スキムミルク中で 1 時間反応させます。膜をHRP基質（Luminata Forte、Millipore Corp.、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）とともに5分間インキュベートし、発光画像分析装置LAS-4000（富士フイルムライフサイエンス、東京、日本）で観察した。バンド密度は、ImageJ ソフトウェアを使用して分析しました。

対照マウスおよび RhoA cKO マウスから採取した瞬間凍結した大動脈サンプルを粉砕し、PBS で 4 ℃で 30 分間 1 回洗浄しました。コラーゲン合成を評価するために、サンプルのアリコートをペプシン消化せずに新しいチューブに移し、総コラーゲン含有量を測定しました。 16,000 × g、4 ℃で 30 分間遠心分離した後、沈殿したサンプルを、1 mg/mL のペプシンを含む 0.5 mol/L 酢酸中で、穏やかに回転させながら 4 ℃で 16 時間消化しました。未消化のサンプルを 4 ℃、16,000 × g で 30 分間の遠心分離によって集め、架橋コラーゲンとして収集しました。上清を非架橋コラーゲンとして収集し、続いて 2 mol/L NaCl 中で 30 分間沈殿させ、その後 4 ℃、16,000 × g で 30 分間遠心分離しました。総コラーゲン、架橋コラーゲン、および非架橋コラーゲンは、キット (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用して実行されたヒドロキシプロリンアッセイによって定量されました 53。結果は、湿組織重量 1 ミリグラムあたりのヒドロキシプロリンのマイクログラムとして報告されます。

マウス原発大動脈VSMCを単離するために、RhoA cKOマウスおよび対照マウスから大動脈全体を抽出し、小片に切断し、コラゲナーゼI型（Sigma-Aldrich）、エラスターゼ（Sigma-Aldrich）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）でインキュベートしました。 5% CO2 と 95% 空気の加湿雰囲気中、37 °C で 3 ～ 4 時間、トリプシン阻害剤 (Thermo Fisher Scientific) を加えます54。 VSMCは10% FBSを含むDMEM中で培養されました。 70% ～ 80% コンフルエンスにある継代 4 ～ 7 の VSMC を実験に使用しました。 VSMC 集団の特徴は、α-SMA (Santa Cruz Biotechnology) の免疫蛍光染色によって確認されました。インビトロ実験では、細胞を生理食塩水、1 μmol/L AngII、および/または 10 μmol/L DMX-5804 (Selleck、ヒューストン、テキサス州、米国) で処理しました。

プラスミド DNA は、Neon Transfection System (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) によって VSMC に導入されました。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞（１×１０７細胞／１００μＬ）を緩衝液Ｒに再懸濁し、５００ｎｇの各プラスミドと混合した。プラスミド導入パラメータは、パルス電圧１２００Ｖ、パルス幅２０ｍｓ、パルス数２とした。

単離したマウス大動脈を輪切り（幅約 2 mm）に切り、クレブス液を満たした槽内の筋電計（マルチワイヤーミオグラフシステムモデル 620 M、Danish Myo Technology、オーフス、デンマーク）のワイヤーに取り付けました。溶液 (118 mmol/L NaCl、25 mmol/L NaHCO3、11 mmol/L グルコース、4.7 mmol/L KCl、1.17 mmol/L MgSO4、1.2 mmol/L KH2PO4、2.5 mmol/L CaCl2、37 °C)、連続95% の O2 と 5% の CO2 で泡立てます。大動脈は、この状態で 5 分間静止状態に平衡化されました。マウスの大動脈張力は、Multi Wire Myograph System55 を使用して測定されました。得られた圧力は、LabChart 8 ソフトウェア (ADIstruments Inc.、コロラドスプリングス、コロラド州、米国) を使用して監視および記録されました。

豚腱由来 I 型コラーゲン溶液 (新田ゼラチン、大阪、日本)、DMEM (2 回濃縮)、再構成緩衝液 (50 mmol/L NaOH、260 mmol/L NaHCO3、200 mmol/L HEPES)、および DMEM に懸濁した VSMCを氷上で７：２：１：１の比率で混合した。次に、混合溶液 (4 × 105 細胞/mL) を 1 滴 (30 ～ 50 μL) 、6 ウェルプレートのシリコン処理されたカバースリップ上に置きました。プレートを37℃で30分間インキュベートしてゲルを硬化させ、AngII（最終濃度10μmol/L）または生理食塩水を含む10％FBSを含む2mLのDMEMをゲル上に添加した。細胞は、5% CO2 と 95% 空気の加湿雰囲気中、37 °C で 24 時間培養されました。培養後、各ウェルから培地を除去し、ゲルをウェルから注意深く剥がした。次に、分離された VSMC の収縮性を測定するために、0、6、12、24、および 48 時間の時点でゲルの直径を測定しました 56。

大動脈の内皮バリア機能に関連する血管透過性は、エバンスブルー色素 57 を使用する手順によって測定されました。生理食塩水に溶解した１％エバンスブルー色素（ナカライテスク）１００μＬをマウスに静脈内注射した。注射の１０分後、マウスを安楽死させ、大動脈を採取し、１０％ホルマリン溶液で固定した。大動脈を光学顕微鏡で観察して写真を撮影した。エバンスブルー色素で染色された領域を測定して、内皮層の損傷を評価しました。

溶解したヒト大動脈サンプルを 5x 非還元サンプルバッファー (312.5 mmol/L Tris-HCl [pH 6.8]、11.5% SDS、40% グリセロール) と混合し、4 mg/mL を含む 7.5% SDS-PAGE ゲルにロードしました。ゼラチン。 SDS-PAGE 後、ゲルを洗浄バッファー (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7.5]、2.5% Triton X-100、5 mmol/L CaCl2、1 μmol/L ZnCl2) で 37 °C で 2 回洗浄しました。毎回 30 分間、インキュベーションバッファー (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7.5]、1% Triton X-100、5 mmol/L CaCl2、1 μmol/L ZnCl2) 中で穏やかに撹拌しながら 10 分間インキュベートします。その後、新しいインキュベーションバッファーに交換し、37 °C で 24 時間インキュベートします。クマシーブリリアントブルー (CBB; ナカライテスク) 染色後、ゼラチン分解領域は、非分解基質の青色の背景に対して透明で鮮明なバンドとして見えました。バンド密度は、ImageJ ソフトウェア (米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州) を使用して分析しました。

大動脈 VSMC の溶解物をプロテイン G セファロースビーズ (GE Healthcare) で事前に洗浄し、ビーズに非特異的に結合するタンパク質を除去しました。遠心分離後、上清を指定の一次抗体 (1:100 希釈) とともに 4 °C で一晩インキュベートし、続いてプロテイン G セファロースビーズとともに 4 °C で 2 時間インキュベートしました。サンプルを 3000 × g、4 °C で 1 分間遠心分離し、ビーズを RIPA バッファーで 3 回洗浄しました。ビーズに結合したタンパク質を 2x サンプルローディングバッファーで溶出し、ウェスタンブロッティングに使用しました。

LC-MS/MS 分析では、ゲルを CBB で一晩染色し、GFP-RhoA-WT レーンの特定のタンパク質バンドを脱染色後に切除しました。 CBB を完全に脱色するために、ゲル切片を 50% アセトニトリルおよび 50 mmol/L 重炭酸アンモニウム溶液に浸しました。脱イオン水で洗浄した後、スライスを 100% アセトニトリルに 15 分間浸し、Savant SpeedVac (Thermo Fisher Scientific) を使用して完全に乾燥させました。ゲルスライス内のタンパク質を、800 ng/40 μL トリプシン: リシルエンドペプチダーゼ混合物 (1:1) で 37 °C で 16 時間消化しました。消化されたペプチドサンプルを新しいチューブに移し、C18-StageTip (Thermo Fisher Scientific) を使用して脱塩しました。サンプルをSavant SpeedVacで乾燥させた後、10μLの0.1%ギ酸/3%アセトニトリル溶液を加えて、次の適用のためにペプチドを可溶化した。

LC の場合、サンプル 2 μL を、ナノカラム (逆相 ReproSil-Pur C18-AQ 樹脂が充填された 75 μm × 125 mm カラム;日京テクノス株式会社、東京、日本）40 °C。吸収されたペプチドを分離するために、移動相 A (水中の 0.1% ギ酸) と移動相 B (80% アセトニトリル中の 0.1% ギ酸) による勾配溶出プログラムを実行しました: 相 B、0 ～ 4 に対して 2% ～ 8%最小、4 ～ 26 分間で 8% ～ 30%、26 ～ 34 分間で 30% ～ 65%。続いて、Orbitrap Q Exactive HF-X 質量分析装置 (Thermo Fisher Scientific) を用いてタンデム質量分析 (MS/MS) を実施しました。エレクトロスプレーイオン化源は、電圧を 1.7 kV に設定し、イオン移送キャピラリーを 275 °C に設定して、正イオンモードで動作させました。 MS1 スペクトルは、3 × 106 の AGC ターゲットを達成するために、分解能 60,000 で 380 ～ 1240 m/z の範囲で収集されました。荷電状態 2+ ～ 5+ の上位 40 個の前駆体イオンが、段階的に正規化された衝突エネルギーによるフラグメンテーション用に選択されました。 22%、26%、30%。 MS2 スペクトルは 1 × 105 の AGC ターゲットを達成するために 15,000 の解像度で収集されました。動的排除時間は 12 秒に設定されました。データベース検索による生データの処理と分析は、PEAKS STUDIO Desktop Version X + マウス UniProtKB/Swiss-Prot マウスデータベース (UniProt id UP000000589、レビュー済み、正規版、2020 年 2 月 10 日にダウンロード) の 17,023 のタンパク質エントリを参照して実行されました。。ソフトウェアのパラメーターは次のように設定されました。酸化 (+15.99 Da) (メチオニン残基) は、タンパク質の可変修飾とみなされるものとして設定されました。トリプシンによる切断は許可されました。前駆体イオンの質量許容値は ±10.0 ppm に設定され、MS/MS 許容値は 0.015 Da に設定されました。タンパク質識別閾値は、ペプチドおよびタンパク質の誤発見率の両方について <1% に設定されました。 PEAKS Studio ソフトウェアでの誤検出率を推定するために、デコイフュージョン法が適用されました。プロテオーム解析はかずさDNA研究所（木更津市）が実施した。 PSOPIA ソフトウェア (医薬基盤・健康・栄養研究所、茨城県、日本) をインシリコ解析に使用して、MAP4K4 活性を調節する STRIPAK 複合体の成分と相互作用できるタンパク質を同定しました。

活性型 GTP 結合 RhoA は、以前に記載されているように、いくつかの修正を加えたプルダウンアッセイによって検出されました 52。簡単に説明すると、細胞を細胞溶解バッファー (50 mmol/L Tris/HCl [pH 7.5]、0.5 mol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、1% Triton X-100) で溶解しました。細胞抽出液を遠心分離により得、グルタチオンセファロースビーズ（GE Healthcare）と結合したmDia Rho結合ドメインと融合したグルタチオンS-トランスフェラーゼと4℃で一晩インキュベートし、GTP結合RhoAを回収した。ビーズを細胞溶解バッファーで洗浄した後、ビーズに結合したタンパク質をSDSサンプルバッファーで溶出させ、SDS-PAGEを行った後、抗RhoA抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。活性型 GTP 相互作用タンパク質 Set も抗 Set 抗体によって検出されました。

セット siRNA およびネガティブコントロール (スクランブル) RNA は、CUGA7 in vitro 転写キット (Nippon Gene、東京、日本) を使用して生成されました。 siRNA 配列は次のとおりです。セット siRNA 5'-GGATGAAGGTGAAGAAGAT-3' およびスクランブル 5'-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3'。ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。

すべてのデータは、平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表されます。すべての実験は独立して少なくとも 3 回実行されました。統計分析は、Prism 9 ソフトウェア (GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して実行されました。実験群間の統計的差異は、フィッシャーの直接確率検定、両側スチューデント t 検定、一元配置分散分析 (ANOVA)、または二元配置反復測定 ANOVA によって評価されました。 ANOVA が全体的な有意性を示した場合、Bonferroni の事後検定を使用して個人差を評価しました。 p < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

トリミングされていないウェスタンブロット画像を補足図に示します。主要な図のグラフの基礎となるすべてのソースデータは補足データ 2 に示されています。この研究で新たに生成されたプラスミドは、寄託 ID 番号 81677 で Addgene (https://www.addgene.org/) に寄託されています。質量分析ベースのプロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD03682558 とともに PRIDE パートナーリポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアム (http://proteomecentral.proteomexchange.org) に寄託されます。この研究中に生成された、および/または研究中に分析された他のすべてのデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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本研究にあたり、多大な技術的ご支援を賜りました中央研究所の山本武文氏、滋賀医科大学薬理学教室の西栄一郎教授に感謝いたします。本研究の一部は、日本学術振興会科学研究費助成事業<科研費>の助成を受けて行われました。清水明 [21K06854]、MK [21K16086]、佐藤明 [21K09419]、HO [17K08627]および20K08489]; 武田科学財団、内藤財団、洗心医学研究財団、上原HO記念財団

滋賀医科大学生化学・分子生物学教室分子医生化学分野

Md Russell Molla、清水昭男、米野正博、Nor Idayu A. Rahman、Joanne Ern Chi Soh、Le Kim Chi Nguyen、Mahbubur Rahman Khan、Wondwossen Wale Tesega、Si Chen、Xiaoling Pang、アキラ佐藤 & 荻田久和

中国医科大学第四付属病院救急科（中国、瀋陽）

シー・チェン＆シャオリン・パン

大阪国際がんセンター分子生物学部

Miki Tanaka-Okamoto

滋賀医科大学外科心臓血管外科・胸部外科

Noriyuki Takashima & Tomoaki Suzuki

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研究の設計（MRM、清水 A.、HO）、実験の実施、データ取得（MRM、清水 A.、MK、NIAR、JECS、LKCN、MRK、WWT、SC、XP、MT-O.、A.佐藤）、データ解析（MRM、清水 A.、NT、TS、HO）、サンプル提供（MT-O.、NT、TS）、原稿執筆（MRM、清水 A.、HO）。

Correspondence to Hisakazu Ogita.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な担当編集者: 諸石敏郎、マヌエル・ブロイヤー。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Molla, MR、清水 A.、Komeno, M. 他血管平滑筋 RhoA は、MAP4K4 活性を調節することで腹部大動脈瘤の形成に対抗します。 Commun Biol 5、1071 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04042-z

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受信日: 2022 年 4 月 8 日

受理日: 2022 年 9 月 27 日

公開日: 2022 年 10 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04042-z

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血管平滑筋 RhoA は MAP4K4 活性を調節することで腹部大動脈瘤の形成を阻止する